ChiCAST视点
编者按：华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST）是欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）欧洲药敏试验委员会（EUCAST）下设在中国的药敏委员会，该委员会于 2017 年 3 月成立，委员来自中国两岸三地、欧洲、美国，专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容（如方法学、折点等）标准化，开展有价值的药敏相关临床研究，对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定，建立 ChiCAST 网站，传播 EUCAST 文件，开展国际间合作与交流，开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学，促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。
以下由 ChiCAST 委员辜依海教授介绍汉中地区 2012 年-2017 年肺穿组织标本病原学分布特征。
供稿：辜依海（ChiCAST 委员，陕西省汉中市 3201 医院）
张微（陕西省汉中市 3201 医院）
审核：杨启文（ChiCAST 秘书长、常务委员，北京协和医院）
赵颖、黄晶晶（ChiCAST 秘书，北京协和医院）
近几十年来，由于临床广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂等药物的广泛使用，以及器官移植、介入导管技术等的应用，侵袭性肺部感染发病率和病死率在逐年升高，特别对免疫功能低下患者的健康构成了很大的威胁。并且随着各种侵入性治疗和诊断操作技术的提高和推广，实验室检出技术水平的发展，肺部感染患者病原菌检出分布也发生了变化 [1]。
对于不典型肺部感染病患，如肺部真菌、放线菌、分枝杆菌等特殊病原菌的感染，影像学及病理学证据缺乏相应特异性，已经远远不能满足疾病的诊疗。而感染性肺组织标本作为诊断肺部感染相对准确可靠的方法，得到越来越多国内外专家的重视 [2]。
本文报道的是，近年来，汉中地区肺部原发及继发性感染患者，通过 CT 引导获取的肺部穿刺组织标本检出的致肺部感染的病原菌的分布特征。三二〇一医院微免科微生物室自 2012 年至 2017 年，累计收到肺部感染患者经皮肺穿组织标本 877 份，208 份标本检测出病原菌，病原菌分离涵盖真菌、结核、放线菌、厌氧菌等。
一、经皮肺穿组织标本具体处理方法及病原菌分布特征如下：
1、CT 引导下经皮肺穿组织标本处理方法
a.标本接种：
对采集的感染性肺穿组织标本在无菌操作下将其分为两部分，一部分使用高压灭菌后的组织碾磨器碾碎，另外一部分使用无菌剪刀剪碎，将两部分混合后接种于血琼脂平板、不含抗生素的巧克力平板、沙保弱平板、马铃薯葡萄糖琼脂平板、罗氏培养基及厌氧平板，分别置于 35℃ 普通孵箱、CO2 孵箱、25℃ 真菌孵箱及厌氧罐中，进行一般细菌培养、苛养菌培养、放线菌培养、真菌培养及结核分枝杆菌培养。
b.组织标本培养：
真菌培养是将剪碎和碾碎处理的混合组织标本接种于沙保弱培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基，分别置入 35℃ 和 25℃ 孵箱中培养，观察沙保弱培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基上真菌生长情况及生长后菌落生长变化特征（如生长速度、菌落颜色、表面质地等）。当培养基上培养至 28 天未见真菌生长时，发出阴性报告。
c.涂片染色观察：
将混合处理后肺穿标本涂片后进行革兰染色检查、六胺银染色检查及 PAS 染色、抗酸染色检查。真菌涂片主要通过六胺银染色检查、PAS 染色以及 HE 染色之后于显微镜下观察。
d.病原菌鉴定：
细菌、放线菌、抗酸杆菌遵循日常检验流程，通过法国梅里埃 ATB 系统、美国 BDPhoenix 鉴定系统、BRUKER 飞行质谱仪（型号：micraflex lt/sh，软件版本：IVD MALDI Biotyper 2.3）进行病原菌鉴定；对于真菌鉴定流程，沙保弱培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养所得真菌菌株均进行菌落形态及镜下形态观察。如果在 37℃ 和 25℃ 两种环境下都是酵母样菌落，直接接种商品化真菌鉴定卡；如果两种环境下都是丝状真菌，进行乳酸棉酚蓝染色通过显微形态鉴定，并对真菌进行 ITS 鉴定；如果为双向真菌，同样进行乳酸棉酚蓝染色通过显微形态显微形态鉴定，并对真菌进行 ITS 鉴定。
e：
对于疑难菌株进行飞行质谱技术和分子生物学鉴定。
2、肺穿组织阳性标本患者基本特征分布
2012 年-2017 年共收肺穿组织标本 877 份，阳性标本 208 例，占比 23.72%，其中男 157 例，女 51 例，年龄岁 14 岁-81 岁，平均 50.4 岁，入住科室以呼吸科为主（122 例，占比 58.65%），其次为肿瘤科（26 例，占比 12.5%）。
3、病原菌分布特征
208 份阳性标本中，涂片检见病原菌 42 例，占比 20.19%，其中抗酸阳性菌 7 例，革兰阴性菌 8 例，革兰阳性菌 23 例，检见真菌孢子 4 例，涂片检查和培养均阳性 7 例。培养见病原菌 172 例，占比 82.69%，其中厌氧菌 22 株，5 株专性厌氧菌耐氧试验表明为厌氧菌，但是鉴定卡分值较低，不可接受，故未鉴定到种，具体见表 1 ；
肠杆菌科细菌 8 株，包括大肠埃希菌 4 株，肺炎克雷伯菌 3 株，阴沟肠杆菌 1 株，见表 2；
非发酵菌 11 株，其中一株手工生化鉴定为非发酵菌，但是鉴定卡分值较低，不可接受，故未鉴定到种，见表 3；
链球菌 32 株，见表 4；
阳性杆菌 12 株，见表 5；
葡萄球菌 28 株，见表 6；
真菌 57 株，见表 7；
放线菌 3 株，诺卡菌 1 株，流感嗜血杆菌 1 株，结核分枝杆菌 13 株，见表 8。
表 1 208 份肺穿组织阳性标本厌氧菌分布
表 2 208 份肺穿组织阳性标本肠杆菌科细菌分布
表 3 208 份肺穿组织阳性标本非发酵细菌分布
表 4 208 份肺穿组织阳性标本链球菌分布
表 5 208 份肺穿组织阳性标本阳性杆菌分布
表 6 208 份肺穿组织阳性标本葡萄球菌分布
表 7 208 份肺穿组织阳性标本真菌分布
表 8 208 份肺穿组织阳性标本其他病原菌分布
二、结语
通过病理细胞学报告、影像资料、病历查询、临床治疗随访等综合方式分析，208株病原菌中有18株丝状真菌、5株凝固酶阴性葡萄球菌、阳性杆菌不能确定为致病病原菌，其它菌株均与临床症状相符性较高。
CT引导下经皮肺穿刺，可以直接获取病灶处组织，定位准确，操作简便且安全性较高，能够为病原学诊断提供更多的依据。本研究组从肺穿组织分离的病原菌已经涵盖了真菌、结核、放线菌、厌氧菌等大批特殊病原体，为临床抗感染治疗提供了有力证据。由于抗菌药物的应用使病原菌易受损伤，在培养基上生长不良或不易生长，直接影响病原体的检出，但不影响涂片染色后镜下观察，因此建议实验室工作人员注重此类难获取标本的涂片染色显微镜检查，这将是培养结果的有力补充。
临床和实验室要高度重视对各类组织标本病原学的查找，提高处理组织标本的技术水平，密切结合病理细胞学分析，能对感染病原菌的确定起到至关重要的作用。
参考文献
[1] 霍凤芝.下呼吸道细菌感染及耐药菌性分析[J].临床急诊杂志,2011,12(04):278-280.
[2] 常炜. CT引导经皮肺穿刺活检术在疑似肺结核的茵阴病例诊断中的临床应用[A]. 国际数字医学会.2017国际数字医学会数字中医药分会论文集[C].国际数字医学会:,2017:2.
