ChiCAST视点

临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识解读

编者按:华人抗菌药物敏感性试验委员会(ChiCAST)是欧洲临床微生物和感染病学会(ESCMID)欧洲药敏试验委员会(EUCAST)下设在中国的药敏委员会,该委员会于 2017 年 3 月成立,委员来自中国两岸三地、欧洲、美国,专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容(如方法学、折点等)标准化,开展有价值的药敏相关临床研究,对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定,建立 ChiCAST 网站传播 EUCAST 文件,开展国际间合作与交流,开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学,促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。

 

以下为大家带来《临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识解读》。

 

 

供稿:

杨启文(ChiCAST 常务委员、秘书长,北京协和医院)

 

审校:

赵   颖(ChiCAST 学术部秘书,北京协和医院)

黄晶晶(ChiCAST IT 部秘书,北京协和医院)

 

 

 

2016 年,国家卫生计生委办公厅发布《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》(国卫办医函 [2016]1281 号),要求在 2020 年前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设,促进抗菌药物的合理应用,维护人民群众健康。但目前我国临床实验室真菌检测能力仍十分有限。

 

因此,为进一步指导建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求,推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升,提高综合医院真菌感染诊疗能力,由全国多位真菌病专家共同商讨并撰写了《临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识》。

 

本共识包括「前言与概述术语和定义环境和设施要求人员要求仪器和试剂要求检测技术要求对于真菌检测质量保证的要求真菌实验室检测报告要求菌株保留的要求信息化系统的要求」十个章节。

 

真菌检测技术包括形态学检查培养鉴定药敏试验免疫学检测分子生物学检测等。面对多样的真菌检测技术,临床微生物实验室需明确各检测技术的价值,针对不同需求选择恰当的检测技术。

 

共识推荐念珠菌血症患者应进行血培养或血清甘露聚糖/抗甘露聚糖抗体检测;除外阴阴道念珠菌病及口咽/食道念珠菌病外,其它念珠菌病患者,则均推荐血清 G 试验检测;除呼吸道念珠菌病外,其它念珠菌病患者,共识推荐相应部位/组织的真菌镜检或培养。

 

针对除过敏性支气管肺曲霉病外的其它曲霉病患者,共识均强烈推荐组织病理检查或血清 G 试验检测;侵袭性肺曲霉病患者,同时还强烈推荐 BAL 镜检、气管吸取物/BAL 真菌培养、或血清/BAL 的 GM 检测。

 

选择适当的检测技术是准确诊断 IFD 的基础,从标本采集处理到不同检测技术的具体操作/结果解读/评价等是准确诊断 IFD 的关键。

 

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标本采集处理:合格的标本是保证检测结果准确的重要前提。血液是检测 IFD 时最常使用的标本,共识中明确推荐「在抗真菌药物使用前,发热初期或寒战期取静脉血。采集后立即注入血培养瓶内并轻轻摇匀。至少采集 2 套。采血量与培养基比例为 1/10-1/5(必须包括需氧瓶或真菌专用瓶)。2 小时内常温送检。若不能及时送检,则常温保存。严格执行皮肤消毒程序可有效降低血培养的污染率。无菌体液(脑脊液、心包液、腹腔积液和关节液)亦是诊断 IFD 的常用标本,共识中同样指出「除脑脊液外,其余的无菌体液宜置于含肝素的无菌真空采血管,15 min 内送检,若不能及时送检,则常温保存(不能冷藏)。部分新型隐球菌在 37℃ 不生长,建议接种二管分别置 25℃ 及 37℃。

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标本形态学检查:标本的形态学检查应作为真菌性疾病诊断强烈推荐的检测项目。目前临床常用的形态学检查方法包括:真菌免疫荧光法、10%KOH 法、革兰染色及特殊真菌检查。钙荧光白(CFW)或博兰卡风(Blankophor)荧光染色检测法几乎可以检测所有真菌,并且具有高度敏感性和特异性。但某些因素可能造成荧光染色假阴性结果,如:未使用适合波长段的滤光片、标本涂片太厚、染液量过少、染色时间过短、荧光淬灭物质存在等。

 

注:A 图示毛霉(脓液,六胺银染色×400),B 图示耶氏肺孢子菌(支气管肺泡灌洗液,六胺银染色×1000),C 图示曲霉(痰,钙荧光白染色×1000),D 图示曲霉(支气管肺泡灌洗液,10%KOH×400)

图 1. 真菌的不同染色涂片镜检方法

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真菌培养

  • 培养基:包括基础培养基和特殊培养基。沙氏培养基(SDA)、脑心浸膏琼脂、抑制性霉菌琼脂属于基础培养基;特殊培养基包括咖啡酸琼脂(caffeic acid agar,CAA)、鸟食琼脂、KT 培养基和 CHROMagar 念珠菌显色培养基。

  • 培养温度:初代培养建议使用(28±1)℃ 培养。高温辅助培养有助于部分真菌的鉴定,如烟曲霉在 45 ℃ 培养时可用来区别其他曲霉;双相真菌在 37 ℃ 或组织中可以以酵母或小球体形式生长,常用于区别其他真菌。

  • 培养时间:生殖道或黏膜念珠菌培养 7 d。深部标本真菌培养建议 4 周。怀疑罕见真菌或慢生长真菌(如荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌等)感染时,建议培养 6~8 周。

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真菌鉴定

  • 怀疑酵母菌时,首先做湿片镜检,对于黏液型菌落、镜下呈圆形或略椭圆形、无假菌丝的出芽酵母菌应立即判断是否为新型隐球菌/格特隐球菌,可进一步用墨汁染色检测是否存在荚膜(具体操作流程详见图 2)。

 

图 2. 临床常见酵母菌鉴定流程

 

  • 丝状真菌主要通过菌落形态以及显微镜下真菌孢子、菌丝、产孢等特征性结构进行初步判断种属,菌落主要观察其生长速度、质地、高度、边缘形态、正反面颜色等(具体操作流程详见图 3)。

 

图 3. 临床常见丝状真菌的鉴定流程

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真菌药敏试验:真菌药敏结果的解释,应选择与所使用检测方法学相对应的体系标准。对于尚未建立临床折点的药物,部分真菌可提供其流行病学界值(ECVs /ECOFFs)或药代动力学/药效学(PK/PD)折点供临床参考(临床常见菌种真菌药敏试验检测药物建议详见表 1)。

 

表 1. 临床常见菌种真菌药敏试验检测药物建议

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侵袭性真菌病的免疫学诊断:免疫学诊断包括抗原检测和抗体检测;其中抗原检测包括 1,3‑β‑D 葡聚糖检测、半乳甘露聚糖检测和隐球菌荚膜多糖抗原检测等(具体应用详见表 2)。

 

表 2. 侵袭性真菌病免疫学诊断方法

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侵袭性真菌病的分子诊断:分子生物学技术发展迅速,常用技术包括 PCR 技术,质谱检测技术,PCR-电喷射电离质谱技术等。但由于体液中真菌载量低、DNA 抽提困难、易污染、无临床判定标准等问题,分子诊断尚未写入侵袭性真菌病的诊断标准中。

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有效的标本采集及运送、适当的检测技术进行诊断、准确的检测结果报告、严格的报告审核和及时上报等各操作环节均与 IFD 疾病的准确诊断密切相关;因此,IFD 检测的各环节均应快速、准确,且应作为一个整体流程进行系统化管理。共识中亦明确提出了对于 IFD 诊断的信息化系统要求。要求明确

 

  • 信息全流程包括:医嘱开单、标本采集、标本送检接收、标本检测、报告审核、报告展示、菌种保存等,流程中涉及的参与人和时间点需要全程记录,信息可追溯。

  • 医院信息系统(HIS)和实验室信息系统(LIS)同时支持多种报告模板的生成和展示;其中,LIS 支持不合格标本和危急值报告的处置。

 

近年来,临床微生物学已成为国内外热门学科,随着真菌感染在我国呈上升趋势,制定临床微生物实验室真菌检测能力基本标准成为当务之急。目前我国真菌实验室建设无论在硬件、人员方面均处于发展阶段,需综合利用多种检测手段,逐步提高非培养方法的使用,提高检测速度,为早期治疗争取时间。

 

因此,《临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识》的发表为我国微生物实验室建设提供了着实可靠、易于操作的标准化要求;且该共识参照但不局限于 CLSI 等最新国际文件,更符合我国国情,更方便临床操作使用。