ChiCAST视点
编者按：华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST）是欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）欧洲药敏试验委员会（EUCAST）下设在中国的药敏委员会，该委员会于 2017 年 3 月成立，委员来自中国两岸三地、欧洲、美国，专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容（如方法学、折点等）标准化，开展有价值的药敏相关临床研究，对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定，建立 ChiCAST 网站，传播 EUCAST 文件，开展国际间合作与交流，开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学，促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。
以下为大家带来《临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识解读》。
供稿：
杨启文（ChiCAST 常务委员、秘书长，北京协和医院）
审校：
赵 颖（ChiCAST 学术部秘书，北京协和医院）
黄晶晶（ChiCAST IT 部秘书，北京协和医院）
2016 年，国家卫生计生委办公厅发布《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》（国卫办医函 ［2016］1281 号），要求在 2020 年前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设，促进抗菌药物的合理应用，维护人民群众健康。但目前我国临床实验室真菌检测能力仍十分有限。
因此，为进一步指导建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求，推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升，提高综合医院真菌感染诊疗能力，由全国多位真菌病专家共同商讨并撰写了《临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识》。
本共识包括「前言与概述、术语和定义、环境和设施要求、人员要求、仪器和试剂要求、检测技术要求、对于真菌检测质量保证的要求、真菌实验室检测报告要求、菌株保留的要求、信息化系统的要求」十个章节。
真菌检测技术包括形态学检查、培养、鉴定、药敏试验、免疫学检测、分子生物学检测等。面对多样的真菌检测技术，临床微生物实验室需明确各检测技术的价值，针对不同需求选择恰当的检测技术。
共识推荐念珠菌血症患者应进行血培养或血清甘露聚糖/抗甘露聚糖抗体检测；除外阴阴道念珠菌病及口咽/食道念珠菌病外，其它念珠菌病患者，则均推荐血清 G 试验检测；除呼吸道念珠菌病外，其它念珠菌病患者，共识推荐相应部位/组织的真菌镜检或培养。
针对除过敏性支气管肺曲霉病外的其它曲霉病患者，共识均强烈推荐组织病理检查或血清 G 试验检测；侵袭性肺曲霉病患者，同时还强烈推荐 BAL 镜检、气管吸取物/BAL 真菌培养、或血清/BAL 的 GM 检测。
选择适当的检测技术是准确诊断 IFD 的基础，从标本采集处理到不同检测技术的具体操作/结果解读/评价等是准确诊断 IFD 的关键。
标本采集处理：合格的标本是保证检测结果准确的重要前提。血液是检测 IFD 时最常使用的标本，共识中明确推荐「在抗真菌药物使用前，发热初期或寒战期取静脉血。采集后立即注入血培养瓶内并轻轻摇匀。至少采集 2 套。采血量与培养基比例为 1/10-1/5（必须包括需氧瓶或真菌专用瓶）。2 小时内常温送检。若不能及时送检，则常温保存。严格执行皮肤消毒程序可有效降低血培养的污染率。无菌体液（脑脊液、心包液、腹腔积液和关节液）亦是诊断 IFD 的常用标本，共识中同样指出「除脑脊液外，其余的无菌体液宜置于含肝素的无菌真空采血管，15 min 内送检，若不能及时送检，则常温保存（不能冷藏）。部分新型隐球菌在 37℃ 不生长，建议接种二管分别置 25℃ 及 37℃。
标本形态学检查：标本的形态学检查应作为真菌性疾病诊断强烈推荐的检测项目。目前临床常用的形态学检查方法包括：真菌免疫荧光法、10%KOH 法、革兰染色及特殊真菌检查。钙荧光白（CFW）或博兰卡风（Blankophor）荧光染色检测法几乎可以检测所有真菌，并且具有高度敏感性和特异性。但某些因素可能造成荧光染色假阴性结果，如：未使用适合波长段的滤光片、标本涂片太厚、染液量过少、染色时间过短、荧光淬灭物质存在等。
注：A 图示毛霉（脓液，六胺银染色×400），B 图示耶氏肺孢子菌（支气管肺泡灌洗液，六胺银染色×1000），C 图示曲霉（痰，钙荧光白染色×1000），D 图示曲霉（支气管肺泡灌洗液，10%KOH×400）
图 1. 真菌的不同染色涂片镜检方法
真菌培养：
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培养基：包括基础培养基和特殊培养基。沙氏培养基（SDA）、脑心浸膏琼脂、抑制性霉菌琼脂属于基础培养基；特殊培养基包括咖啡酸琼脂（caffeic acid agar，CAA）、鸟食琼脂、KT 培养基和 CHROMagar 念珠菌显色培养基。
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培养温度：初代培养建议使用（28±1）℃ 培养。高温辅助培养有助于部分真菌的鉴定，如烟曲霉在 45 ℃ 培养时可用来区别其他曲霉；双相真菌在 37 ℃ 或组织中可以以酵母或小球体形式生长，常用于区别其他真菌。
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培养时间：生殖道或黏膜念珠菌培养 7 d。深部标本真菌培养建议 4 周。怀疑罕见真菌或慢生长真菌（如荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌等）感染时，建议培养 6～8 周。
真菌鉴定：
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怀疑酵母菌时，首先做湿片镜检，对于黏液型菌落、镜下呈圆形或略椭圆形、无假菌丝的出芽酵母菌应立即判断是否为新型隐球菌/格特隐球菌，可进一步用墨汁染色检测是否存在荚膜（具体操作流程详见图 2）。
图 2. 临床常见酵母菌鉴定流程
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丝状真菌主要通过菌落形态以及显微镜下真菌孢子、菌丝、产孢等特征性结构进行初步判断种属，菌落主要观察其生长速度、质地、高度、边缘形态、正反面颜色等（具体操作流程详见图 3）。
图 3. 临床常见丝状真菌的鉴定流程
真菌药敏试验：真菌药敏结果的解释，应选择与所使用检测方法学相对应的体系标准。对于尚未建立临床折点的药物，部分真菌可提供其流行病学界值（ECVs /ECOFFs）或药代动力学/药效学（PK/PD）折点供临床参考（临床常见菌种真菌药敏试验检测药物建议详见表 1）。
表 1. 临床常见菌种真菌药敏试验检测药物建议
侵袭性真菌病的免疫学诊断：免疫学诊断包括抗原检测和抗体检测；其中抗原检测包括 1，3‑β‑D 葡聚糖检测、半乳甘露聚糖检测和隐球菌荚膜多糖抗原检测等（具体应用详见表 2）。
表 2. 侵袭性真菌病免疫学诊断方法
侵袭性真菌病的分子诊断：分子生物学技术发展迅速，常用技术包括 PCR 技术，质谱检测技术，PCR-电喷射电离质谱技术等。但由于体液中真菌载量低、DNA 抽提困难、易污染、无临床判定标准等问题，分子诊断尚未写入侵袭性真菌病的诊断标准中。
有效的标本采集及运送、适当的检测技术进行诊断、准确的检测结果报告、严格的报告审核和及时上报等各操作环节均与 IFD 疾病的准确诊断密切相关；因此，IFD 检测的各环节均应快速、准确，且应作为一个整体流程进行系统化管理。共识中亦明确提出了对于 IFD 诊断的信息化系统要求。要求明确：
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信息全流程包括：医嘱开单、标本采集、标本送检接收、标本检测、报告审核、报告展示、菌种保存等，流程中涉及的参与人和时间点需要全程记录，信息可追溯。
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医院信息系统（HIS）和实验室信息系统（LIS）同时支持多种报告模板的生成和展示；其中，LIS 支持不合格标本和危急值报告的处置。
近年来，临床微生物学已成为国内外热门学科，随着真菌感染在我国呈上升趋势，制定临床微生物实验室真菌检测能力基本标准成为当务之急。目前我国真菌实验室建设无论在硬件、人员方面均处于发展阶段，需综合利用多种检测手段，逐步提高非培养方法的使用，提高检测速度，为早期治疗争取时间。
因此，《临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识》的发表为我国微生物实验室建设提供了着实可靠、易于操作的标准化要求；且该共识参照但不局限于 CLSI 等最新国际文件，更符合我国国情，更方便临床操作使用。