ChiCAST视点
编者按：华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST）是欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）欧洲药敏试验委员会（EUCAST）下设在中国的药敏委员会，该委员会于 2017 年 3 月成立，委员来自中国两岸三地、欧洲、美国，专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容（如方法学、折点等）标准化，开展有价值的药敏相关临床研究，对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定，建立 ChiCAST 网站，传播 EUCAST 文件，开展国际间合作与交流，开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学，促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。
以下为大家带来《隐球菌的新发现》。
供稿：
陈新飞 （ChiCAST IT 部秘书 北京协和医院）
黄晶晶 （ChiCAST IT 部秘书 北京协和医院）
审校：
肖 盟 （ChiCAST 学术部秘书 北京协和医院）
近年来由隐球菌引起感染的患者逐渐增多，新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）和格特隐球菌（Cryptococcus gattii）是临床中重要的真菌性病原体，可能引起致命的脑膜脑炎。最新研究表明，全球每年大约有 223,000 新发病例，引起 181,000 人死亡 [1]。最近的两项研究中，分别对新型隐球菌和格特隐球菌毒力相关研究进行了报道。
宿主 CO 2 浓度
筛选高毒力新型隐球菌的独立影响因素
新型隐球菌在自然界中广泛分布。在导致宿主患病时，新型隐球菌需要从环境中转移到宿主体内，而宿主体内的 CO2 浓度是环境中的 125 倍。目前已发现的体外表型（对宿主温度的耐受，黑色素化及荚膜形成）仍不能完全预测菌株的毒力 [2]，而有证据表明新型隐球菌对宿主 CO2 浓度的耐受性，可能是其导致哺乳动物患病的一个潜在的重要特征。
来自美国爱荷华大学卡弗医学院的研究者 [3] 收集了 12 株新型隐球菌分别观察了在大气环境和 5% CO2 环境中的生长状况。采用竞争实验观察对 CO2 敏感的环境株和对 CO2 耐受的质控株混合后分别在大气环境和 5% CO2 环境中培养，观察两者的生长情况。将两株不同基因型（AA 和 DD）的质控株杂交，分析子代对 CO2 的耐受性及遗传方式。通过小鼠和大蜡螟模型比较对 CO2 敏感和耐受菌株的毒力差异。分别测定培养在大气环境和 5% CO2 环境下菌株的抗真菌药物敏感性。
竞争实验中，对 CO2 敏感的环境株生长具有缺陷，且在 CO2 环境中培养生长缺陷更明显。质控株杂交子一代 AD 菌株对 CO2 耐受，其遗传方式为显性遗传。动物感染模型中，感染 CO2 敏感环境株的小鼠脑真菌载量比感染 CO2 耐受环境株的小鼠低约 100 倍，感染 H99 参考菌株的小鼠脑真菌载量和感染 CO2 耐受环境株相似。感染 CO2 耐受环境株小鼠的中位生存期略长于感染高毒力 H99 参考菌株的小鼠。大蜡螟模型结果与小鼠模型一致。
药敏实验中，两性霉素 B 的最小抑菌浓度（MIC）不受 CO2 浓度的影响；在 5% CO2 中，对 CO2 耐受和敏感的菌株对氟康唑和伊曲康唑的 MIC 均下降。
综上所述，菌株对 CO2 的耐受性可能对其毒力和抗真菌药敏感性存在影响，但具体的相关机制目前仍未知，未来仍需进一步研究。
抑制格特隐球菌荚膜形成
大环内酯类药物
格特隐球菌常在热带和亚热带地区流行，以吸入感染为主。免疫细胞的吞噬作用是清除格特隐球菌的主要方式，能够特异性的识别隐球菌的细胞壁和荚膜，促进炎症因子释放和 T 细胞的抗真菌作用 [4]。大环内酯类药物除抑制蛋白质合成外，越来越多的研究发现其能够调节过度的炎症反应，以及抑制细菌的毒力因子（荚膜等）合成，但目前其对真菌的影响仍未知，本研究旨在探究大环内酯类药物对格特隐球菌的毒力影响。
来自日本东京国家传染病研究所的研究者 [5] 分别将 4 株格特隐球菌在含克拉霉素（CAM）的 YPD 液体培养基中进行培养，测定不同浓度 CAM 对隐球菌荚膜大小和多糖含量的影响。通过过氧化氢敏感性实验，调理吞噬杀菌实验和小鼠巨噬细胞吞噬作用等实验，检测 CAM 对格特隐球菌氧化应激能力，中性粒细胞的杀伤作用及细胞因子释放水平的影响。通过蛋白免疫印迹法（Western blot）和反转录 PCR（RT-PCR），分析了 CAM 对格特隐球菌 Hog1 磷酸化水平和部分毒力基因 mRNA 表达量的影响。测定 CAM 处理后格特隐球菌对氟康唑（FLCZ），伏立康唑（VRCZ），5-氟胞嘧啶（5-FC），两性霉素 B（AMPH-B）的药物敏感性。
CAM 处理能够降低格特隐球菌荚膜的厚度和多糖的含量，且 CAM 处理后格特隐球菌对 H2O2 的氧化应激能力、嗜中性粒细胞的吞噬杀伤作用均有提高。小鼠巨噬细胞对处理后格特隐球菌的吞噬能力增强，且释放的肿瘤坏死因子增多。Western blot 和 RT-PCR 显示，CAM 处理后，格特隐球菌的磷酸化 Hog1 和总 Hog1 蛋白表达量均降低，LAC1 等毒力相关基因 mRNA 表达量也降低。药物敏感性实验中，CAM 处理后格特隐球菌对 FLCZ，VRCZ，5-FC 的 MIC 值均降低 2 倍，而 AMPH-B 则无变化。综上所述，大环内酯类药物可能影响格特隐球菌的荚膜和毒力，该研究为治疗难治性隐球菌感染的提供了新的手段。
上述研究的结果为临床筛选高毒力新型隐球菌和治疗难治性格特隐球菌感染提供了全新的思路。其中关于 5% CO2 环境下的药敏实验结果更是打破了传统认知。不过，在 CO2 环境下进行培养的药敏结果和临床实际治疗效果的相关性，以及大环内酯类药物同传统抗真菌药物联合应用是否会有更好的临床效果等问题，仍需要进一步临床研究证实。