ChiCAST视点
编者按：华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST）是欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）欧洲药敏试验委员会（EUCAST）下设在中国的药敏委员会，该委员会于 2017 年 3 月成立，委员来自中国两岸三地、欧洲、美国，专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容（如方法学、折点等）标准化，开展有价值的药敏相关临床研究，对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定，建立 ChiCAST 网站，传播 EUCAST 文件，开展国际间合作与交流，开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学，促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。
以下为大家带来《新冠文献速递之病毒生物学特征》。
撰稿：
郁瑾菡、黄晶晶（北京协和医院）
范欣（首都医科大学附属北京朝阳医院、ChiCAST 学术部秘书）
闫梦瑶（北京大学临床药理研究所）
王贺（北京市重点实验室丹娜生物分中心、ChiCAST 委员）
审校：
赵 颖（ChiCAST 学术部秘书 北京协和医院）
冠状病毒（Coronavirus，CoV）
是一类单链正股 RNA 病毒，可以分为 4 个属（α, β, γ及δ）。其基因组通常编码四种结构蛋白：刺突（spike，S），被膜（envelope，E），包膜（membrane，M），核衣壳（nucleocapsid，N）以及一些非结构蛋白及独特的配件蛋白。所有冠状病毒都是人兽共患，且蝙蝠被认为是冠状病毒的重要宿主。
已知有 6 种冠状病毒能够在人类传播：人α冠状病毒 229E 和 NL63 以及人β冠状病毒 OC43 和 HKU1 能够引起轻微的上呼吸道感染；其他两种β冠状病毒 SARS-CoV 和 MERS-CoV 对人类具有高致病性，其致死率分别为 10% 和 35%。
2019 年底在湖北省暴发了一种严重呼吸系统疾病，现已命名为 2019 新型冠状病毒病（COVID-19），疫情暴发后，进展迅速。流行病学调查提示此次疫情暴发与武汉的一家海鲜市场有关。来自中国复旦大学、中国疾病预防控制中心、华中科技大学和武汉市疾病预防控制中心 Zhang YZ 等研究者对一名在这家海鲜市场工作的肺炎患者进行研究 [1]。
为了研究与这种疾病相关的可能病原体，研究者收集患者支气管肺泡灌洗液（BALF）并从中提取总 RNA，使用 Illumina MiniSeq 进行双端（150 bp）测序构建出宏转录组文库，筛选出一种与之前在中国采样获得的蝙蝠 SARS 样冠状病毒分离株（bat-SL-CoVZC45）具有密切亲缘关系的新型病毒，其核苷酸序列同一性为 89.1%。
随后，此新型病毒被命名为 WH-Human 1 冠状病毒（WHCV，现被称为 SARS-CoV-2）。
研究者将 WHCV 与人类起源的冠状病毒（SARS-CoV Tor2）和 bat-SL-CoVZC45 进行了序列对比。结果发现，WHCV 病毒基因组类似于这两种冠状病毒，且具有典型的β冠状病毒的 5' 和 3' 末端序列，基因次序为：5'-replicase ORF1ab-S-E-M-N-3'。为了确定 WHCV 与先前发现的冠状病毒之间的进化关系，基于整个基因组序列估算系统进化树发现，在所有系统进化树中，WHCV 与 Sarbecovirus 亚属的成员以及从蝙蝠中采集的许多 SARS 样冠状病毒簇集在一起，属于β冠状病毒属（Sarbecovirus 亚属）中的一种新型病毒。
为了更好地了解 WHCV 感染人类的潜力，研究人员对其 S 蛋白的受体结合结构域（RBD）与 SARS-CoV 和 bat-SL-CoVZC45 进行了比较。WHCV RBD 序列与 SARS-CoV RBD 序列和能够利用人 ACE2 受体进入细胞的 SARS 样冠状病毒存在更为密切的亲缘关系。
此外，研究者进行蛋白同源性建模来预测 WHCV RBD 结构域的三维蛋白结构，并将其与 SARS-CoV RBD 结构域的晶体结构进行比较发现，WHCV 和 SARS-CoV RBD 结构域在氨基酸序列和预测的蛋白结构方面存在高度相似性，这就表明 WHCV 可能有效地利用人 ACE2 作为细胞进入受体，从而潜在地促进人与人之间的传播。
除外，研究人员还对 SARS-CoV-2 及其他四种代表性冠状病毒的全基因组序列进行了重组检测，虽然检测到一些重组事件，但目前还不能证明人α冠状病毒 229E 和 NL63 以及人β冠状病毒 OC43 和 HKU1 与 SARS-CoV-2 的出现相关。
Zhang YZ 团队认为，冠状病毒与人类的许多传染病疫情相关，尽管自 2005 年以来在包括蝙蝠在内的哺乳动物中广泛发现了 SARS 样冠状病毒，导致人们认为这些动物是这些病毒的天然宿主，但尚未在动物中发现与 SARS-CoV 相同的病毒，因此此次感染人类的冠状病毒的确切来源尚不清楚，未来还需要开展更多的研究工作来确定 SARS-CoV-2 的天然宿主和中间宿主。
在未知「SARS-CoV-2 可能是蝙蝠来源的冠状病毒」的情况下，来自中国医学科学院病原微生物研究所的 Ren LL 团队，收集武汉金银潭医院于 2019 年 12 月 18 日至 29 日收治的 5 位肺炎患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）以及相关病例和流行病学信息，发现了一种能够引起重症甚至致死性肺炎的病毒 [2]。
该研究对 BALF 进行基因组测序，并对序列进行了系统发育分析。同时，用 Vero 细胞系进行病毒株的分离培养及免疫荧光分析。
BALF 基因组序列分析显示，1 位患者的 BALF 标本 80.3%reads 几乎全部定位到冠状病毒基因组，其他 4 位患者也一定比例 reads 定位在β-CoVs。采用 Sanger 测序进行基因组确认，发现 5 位患者 BALF 基因组序列相似度达 99.9%。基因组全长 29,870bp，GC 含量 37.99%-38.02%。基因组结构 5』-ORF1ab-S-E-M-N-3』，与 SARS-CoV 相似且具有 Sarbecovirus 亚属特征的 ORF3，ORF6，ORF7，ORF8 基因。
基因组全长同源性比对发现，其与 SARS-CoV Tor2 相似度 79.0%，与 MERS-CoV 相似度 51.8%。与分离自中华菊头蝠的蝙蝠冠状病毒 SL-CoV ZC45 和 ZXC21 有 87.6% 和 87.7% 的相似度。然而，冠状病毒高度保守的 RdRp 序列与 SL-CoV ZC45 相比，只有 86.3%-86.5% 的相似度，故认为新发现的冠状病毒种应该为 Betacoronavirus 属，Sarbecovirus 亚属下的一种新型冠状病毒。
根据最大相似模型构建的系统发育树显示，新发现的冠状病毒虽然与蝙蝠冠状病毒 SL-CoV ZC45 和 ZXC21 相似，但分属 Sarbecovirus 亚属不同的进化分支。蝙蝠来源特征性的 ORF3 和 ORF8 基因出现在新型冠状病毒基因组，这些发现进一步提示新型冠状病毒来源于蝙蝠。
同样，Lu R 等研究者 [3] 认为 SARS-CoV-2 的来源可能是蝙蝠，但是华南海鲜市场未知的野生动物可能作为中间宿主，参与病毒传播。
主要原因：
1.最初在 2019 年 12 月底出现了感染暴发，但当时武汉大多数的蝙蝠正处在冬眠；
2.华南海鲜市场并没有售卖也并没有发现蝙蝠，但有其他的非水产动物（包括哺乳动物）售卖；
3.新型冠状病毒与蝙蝠来源 SL-CoVZXC21 相似度低于 90%，系统发育上仍有一定距离，因此，并不是新型冠状病毒的直接祖先；
4.SARS-CoV 和 MERS-CoV 都是以蝙蝠作为自然贮存宿主，其他动物作为中间宿主，人类作为终宿主。
冠状病毒 S 蛋白的 RBD 决定了宿主的种类范围。Lu R 团队研究后同样认为新型冠状病毒可能以人 ACE2 为受体。
以上研究结果共同揭示：2019 新型冠状病毒很可能来源于蝙蝠。
首先，SARS-CoV-2 的基因组与 bat-SL-CoV ZC45 有很高的相似度；
其次，系统发育分析显示它与 bat-SL-CoVs ZXC21 及 ZC45 进化相近；
第三，SARS-CoV-2 含有蝙蝠来源冠状病毒特征性的 ORF3 及完整的 ORF8 基因。另外，SARS-CoV-2 的 N 末端区域（NTDs）氨基酸序列与 bat-SL-CoVs ZXC21 及 ZC45 相似，同时 RBD 与 SARS-CoV 的相似度高于 ZC45 及 ZXC21，提示 S 基因的 NTD 和 RBD 可能出现重组，促进了跨物种传播
参考文献
[1] Wu F, Zhao S, Yu B, et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China[J]. Nature, 2020, 579(7798): 265-269.
[2] Ren LL, Wang YM, Wu ZQ, et al. Identification of a novel coronavirus causing severe pneumonia in human: a descriptive study[J]. Chin Med J (Engl), 2020.
[3] Lu R, Zhao X, Li J, et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding[J]. Lancet, 2020, 395(10224): 565-574.