ChiCAST视点
编者按：华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST）是欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）欧洲药敏试验委员会（EUCAST）下设在中国的药敏委员会，该委员会于 2017 年 3 月成立，委员来自中国两岸三地、欧洲、美国，专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容（如方法学、折点等）标准化，开展有价值的药敏相关临床研究，对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定，建立 ChiCAST 网站，传播 EUCAST 文件，开展国际间合作与交流，开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学，促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。
以下为大家带来《新冠文献速递之实验室检测及技术应用 》。
撰稿：
郁谨菡、黄晶晶、陈新飞（北京协和医院、ChiCAST IT 部秘书）
审校：
程敬伟（首都医科大学附属北京友谊医院、ChiCAST 学术部秘书）
传染性疾病的暴发流行威胁到人类的健康，快速准确的诊断病原是控制疾病传播和治疗的关键。mNGS（宏基因组二代测序）作为传染性疾病病原诊断的有力工具，在诊断确定病原的同时，也提供了病原体丰度、基因序列和基因表达量等大量能够揭示病因的数据信息。
2019 年 12 月引起武汉疫情的病原体，在常规实验室检查中无法明确，但流行病学调查发现大多数感染者曾有华南海鲜市场接触史。来自武汉大学中南医院 Chen L 等研究者通过 mNGS 对引起武汉疫情的潜在病原进行快速诊断 [1]。
研究者对 2 名发热患者分别进行临床实验室检查和影像学检查，采集患者呼吸道及血液标本进行常规呼吸道病原体检测，依据检测结果和 WHO 文件建议进行 SARS-CoV 特异性 RT-PCR 检测，对扩增产物进行测序及序列比对。
根据比对结果重新设计特异引物进行 RT-PCR 检测，对扩增产物再次测序及序列比对。采集患者的支气管肺泡灌洗液（BALF），提取总 RNA，构建 RNA 基因文库，最终进行 mNGS 分析，并将该测序数据与数据库中序列进行了全基因组比对和进化分析。
结果显示，2 名患者常规呼吸道病原体检测均为阴性，SARS-CoV 特异性 RT-PCR 扩增产物电泳仅 SAR1-s/as 条带阳性，测序结果比对与蝙蝠冠状病毒（BtCoV / 4991）RdRp 基因一致性最高；RdRp、衣壳蛋白（NP）等基因一致性较高。mNGS 鉴定结果具有很高的丰度水平，整个病毒基因组的长度为 29,881 个碱基。
开放阅读框 1b（ORF1b）蛋白序列系统发育与β属冠状病毒在同一分支。基于基因组比对的基因重组分析发现，SARS-CoV-2 与 SARS CoVs 和中华菊头蝠冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）在不同基因位置上的相似程度存在差异。参考不同病毒关键基因特异性系统发育分析发现，SARS-CoV-2 与 bat-SL-CoVs 等病毒存在差异，但均与 SARS CoVs 亲缘关系较远。
因此，基于全基因组的进化分析 SARS-CoV-2 更有可能是一种从动物传播给人类的新型重组冠状病毒。mNGS 作为病原学诊断的有力工具，为检测潜在的病原体提供了大量信息，日益成为信息时代新发病原诊断的新趋势。
研究分为两个阶段，第一阶段纳入 39 名患者，测试样本中是否都能检出病毒（qRT-PCR 法）；第二阶段，纳入已入院治疗近 10 天的 139 名患者，动态监测病毒载量和抗体水平。
第一阶段结果显示，即使口腔拭子中无法检出病毒核酸，也可以在肛拭子或血液中检出；拭子检测是阴性的患者仍可能是病毒血症
第二阶段研究结果显示，相比入院当天和入院第五天，患者血清 IgM 阳性率从 50% (8/16) 增加到 81% (13/16)，IgG 阳性率从 81% (13/16) 增加到 100% (16/16)；口腔拭子病毒检测阳性率从 50% 下降至 25%，肛拭子的病毒阳性率从 25% 增加至 37.5%，提示新冠感染病程可能从早期更多的口腔拭子阳性转变为后期的更多肛拭子阳性。
因此，COVID-19 患者可能通过呼吸道、粪-口或体液途径释放 SARS-CoV-2。此外，当口腔拭子核酸检测阴性时，病毒可能存在于肛拭子和血液中，故不能单纯根据口腔拭子阴性作为出院指标。
并且，当病毒血症患者的拭子核酸检测结果均为阴性，强烈建议使用病毒 IgM 和 IgG 血清学检测来进行感染确认。在 SARS-CoV-2 的实验室检测中，鼻咽、口咽拭子采集有传染风险，会造成患者不适且不便于病毒载量监测。
研究者收集 12 名 COVID-19 患者入院后 0-7 天在含病毒转运培养基的无菌容器中自行留取的唾液，采用自制一步法 RT-qPCR 检测 SARS-CoV-2 刺突蛋白基因，通过 Vero E6 细胞与唾液共孵育进行病毒培养。
核酸检测发现，91.7% 患者（11/12）的首份唾液标本检测阳性。接受连续唾液检测的患者中，83.3%（5/6）的患者首次采集的唾液样本病毒载量最高。
病毒培养发现，3 名患者的唾液中有活病毒存在。因此，唾液样本可用于大规模人群筛查和病程监测。在医务人员紧张情况下，患者自采样本，减少了取样等待时间，使得结果更易获得。但是，还需要进一步研究来确定唾液中 SARS-CoV-2 的来源。
目前，已证实 SARS-CoV-2 主要感染下呼吸道，但没有关于病毒在上、下呼吸道标本中释放差异性的资料，且实验室诊断相关研究多采用下呼吸道标本。
然而，下呼吸道标本（通常为支气管肺泡灌洗液，BALF）采集难度大并对患者造成痛苦，不适用于常规检测。相反，上呼吸道标本（鼻咽拭子、咽拭子和痰液）采集快速简单且相对安全。
为研究上呼吸道标本在 SARS-CoV-2 诊断中的准确性，比较新冠病毒在轻症和重症患者中分布和释放的情况，来自国家传染病临床研究中心的 Yang Y 等研究者对上呼吸道标本在 SARS-CoV-2 诊断和监测中的准确性进行研究 [4]。
收集由广东省 CDC 确诊的 213 名新冠病毒感染者的呼吸道标本，通过 qRT-PCR 技术检测病毒 RNAs，结合标本采集时间和临床资料分析发现，新冠病毒的实验室诊断中痰标本最敏感，其次是鼻咽拭子，而不推荐咽拭子；病毒的分布与疾病的严重程度有关，重症患者 BLAF 的病毒 RNAs 检测对于诊断和监测病毒释放是必要的；有接触史及临床症状的疑似患者，在上呼吸道标本检测阴性的情况下，CT 扫描对诊断有重要的参考价值。
考虑到只有小部分（28%）患者可采集到痰标本，故鼻咽拭子可能是最为广泛应用的新冠病毒检测标本。
参考文献
[1] Chen L, Liu W, Zhang Q, et al. RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak[J]. Emerg Microbes Infect, 2020, 9(1): 313-319.
[2] Zhang W, Du RH, Li B, et al. Molecular and serological investigation of 2019-nCoV infected patients: implication of multiple shedding routes[J]. Emerg Microbes Infect, 2020, 9(1): 386-389.
[3] To KK, Tsang OT, Chik-Yan Yip C, et al. Consistent detection of 2019 novel coronavirus in saliva[J]. Clin Infect Dis, 2020.
[4] Yang Y YM, Shen CG, et al. Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCoV infections[J]. Med Rxiv, 2020.