ChiCAST视点
编者按：华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST）是欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）欧洲药敏试验委员会（EUCAST）下设在中国的药敏委员会，该委员会于 2017 年 3 月成立，委员来自中国两岸三地、欧洲、美国，专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容（如方法学、折点等）标准化，开展有价值的药敏相关临床研究，对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定，建立 ChiCAST 网站，传播 EUCAST 文件，开展国际间合作与交流，开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学，促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。
以下为大家带来《光滑念珠菌高水平棘白菌素耐药新机制》。
供稿：
侯欣（北京协和医院）
审校：
程敬伟（ChiCAST 学术部秘书 首都医科大学附属北京友谊医院）
光滑念珠菌是美国和欧洲第二大最常见的念珠菌种 [1]，可引起血流感染、感染性心内膜炎、腹腔感染等，光滑念珠菌血症的病死率高达 50%[2]。
我国大规模多中心侵袭性真菌监测网（CHIF-NET）的监测数据显示，光滑念珠菌是我国分离率排第四位的念珠菌 [3]。光滑念珠菌对唑类药物天然敏感性低，且耐药率有升高趋势 [1]。IDSA 指南推荐棘白菌素类药物作为光滑念珠菌侵袭性感染治疗的首选药物 [4]。但随着药物使用量的增加，光滑念珠菌对棘白菌素的耐药率日益增高，在部分地区已超过 10%[5]，给临床治疗带来严峻挑战，但我国菌株的耐药率低于 1%[6]。
本实验室报道了我国首例棘白菌素耐药光滑念珠菌引起的感染，且该株菌对三种棘白菌素药物的 MIC 均 ≥ 8 μg/ml。光滑念珠菌棘白菌素耐药的主要机制为发生 FKS 热点区（hot spot，HS）突变，而该株菌 FKS HS 测序未发现突变，仅在 FKS2 HS1 上游发现 E655K 突变 [7]。
本研究对我国首例棘白菌素耐药光滑念珠菌的 FKS1 和 FKS2 ORF 扩增测序发现，除 E655K 突变外，还有 FKS1 无义突变（W508stop）。利用 CRISPR Cas9 基因编辑技术在野生型标准株（ATCC 2001）上构建菌株 CRISPR 31（Fks1 WT/Fks2-E655K）；利用同源重组定点突变技术在 fks1Δ 上构建菌株 fks1Δ/ Fks2-E655K，比较不同菌株葡聚糖合成酶的活性、FKS mRNA 表达（RT-PCR）、蛋白表达（Western blot）以及小鼠感染后对米卡芬净的应答情况。
结果表明，与野生型 ATCC 2001 相比：CRISPR 31 菌株棘白菌素 MIC 仅轻微升高，FKS mRNA 表达和 Fks1/Fks2 蛋白表达无明显差异，葡聚糖合成酶活性和体内动物试验均表现为低耐。fks1Δ/ Fks2-E655K 菌株葡聚糖合成酶的活性在米卡芬净作用下无显著下降，FKS2 介导的高水平棘白菌素耐药可被 FK506 逆转；FKS1 基因转录水平表达下降，FKS2 表达上调；Fks1/Fks2 蛋白表达明显下降。在小鼠侵袭性光滑念珠菌感染模型中，ATCC 2001 组小鼠肾脏 CFU 显著降低（P <0.01），CRSIPR 31 和 fks1Δ/Fks2-E655K 组，与空白对照组相比，无显著差异（P >0.05），表明米卡芬净对 E655K 突变组的小鼠无效。
本研究从体外试验和体内动物试验深度阐明临床棘白菌素高耐光滑念珠菌的主要耐药机制是 FKS2 E655K 突变和 FKS1 功能缺失，为控制耐药发生发展和指导临床更加合理地使用抗真菌药物提供新的理论依据与有益借鉴。
参考文献
[1] Kumar K, Askari F, Sahu MS, and Kaur R. Candida glabrata: a lot more than meets the eye[J]. Microorganisms. 2019,7(2):1-22.
[2] Glockner A, and Cornely OA. Candida glabrata--unique features and challenges in the clinical management of invasive infections[J]. Mycoses. 2015,58(8):445-450.
[3] Xiao M, Sun ZY, Kang M, Guo DW, Liao K, Chen SC, Kong F, Fan X, Cheng JW, Hou X, Zhou ML, Li Y, Yu SY, Huang JJ, Wang H, Xu YC, and China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net Study G. Five-year national surveillance of invasive candidiasis: species distribution and azole susceptibility from the China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net (CHIF-NET) Study[J]. J Clin Microbiol. 2018,56(7):e00577-00518.
[4] Pappas PG, Kauffman CA, Andes DR, Clancy CJ, Marr KA, Ostrosky-Zeichner L, Reboli AC, Schuster MG, Vazquez JA, Walsh TJ, Zaoutis TE, and Sobel JD. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America[J]. Clin Infect Dis. 2016,62(4):e1-50.
[5] Farmakiotis D, Tarrand JJ, and Kontoyiannis DP. Drug-resistant Candida glabrata infection in cancer patients[J]. Emerg Infect Dis. 2014,20(11):1833-1840.
[6] Hou X, Xiao M, Chen SC, Kong F, Wang H, Chu YZ, Kang M, Sun ZY, Hu ZD, Li RY, Lu J, Liao K, Hu TS, Ni YX, Zou GL, Zhang G, Fan X, Zhao YP, and Xu YC. Molecular epidemiology and antifungal susceptibility of Candida glabrata in China (August 2009 to July 2014): a multi-center study[J]. Front Microbiol. 2017,8(880):1-9.
[7] Xiao M, Fan X, Hou X, Chen SC, Wang H, Kong F, Sun ZY, Chu YZ, and Xu YC. Clinical characteristics of the first cases of invasive candidiasis in China due to pan-echinocandin-resistant Candida tropicalis and Candida glabrata isolates with delineation of their resistance mechanisms[J]. Infect Drug Resist. 2018,11:155-161.