ChiCAST视点
编者按：华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST）是欧洲临床微生物和感染病学会（ESCMID）欧洲药敏试验委员会（EUCAST）下设在中国的药敏委员会，该委员会于 2017 年 3 月成立，委员来自中国两岸三地、欧洲、美国，专家领域涵盖临床微生物学、临床感染病学、临床药理学、畜牧兽医学、抗菌药物制药企业及感染诊断企业。委员会下设临床细菌学组、临床真菌学组、临床药理学组、临床感染学组及畜牧兽医学组等亚专业组。主要任务为药敏试验相关内容（如方法学、折点等）标准化，开展有价值的药敏相关临床研究，对有争议的临床标本检测进行确认和鉴定，建立 ChiCAST 网站，传播 EUCAST 文件，开展国际间合作与交流，开展临床微生物实验室标准化培训和宣传教学，促进我国抗菌药物敏感性试验工作的健康发展。
以下为大家带来《非曲霉丝状真菌的实验室鉴定和药敏试验》。
供稿：
李 颖（首都医科大学宣武医院）
审校：
王 瑶（ChiCAST 学术部秘书 北京协和医院）
近年来，机会性丝状真菌感染在免疫受损人群中的发病率有所提升；尽管曲霉仍然是导致侵袭性霉菌病的最主要病原体，接合菌、镰刀菌、赛多孢霉等非曲霉丝状真菌因其感染诊断困难、病死率高、治疗棘手等特点逐渐引起了关注 [1,2]。
非曲霉丝状真菌涵盖种属多，且不同种属菌株对常用抗真菌药物的敏感性存在差异。目前国内大多数微生物实验室对非曲霉丝状真菌的实验室检验能力有限，相关研究数据较少。我们采用 MALDI-TOF MS 和基因测序技术对非曲霉丝状真菌进行菌种鉴定，评估 MALDI-TOF MS 对非曲霉丝状真菌的鉴定能力；药敏试验通过标准微量肉汤稀释法和商品化 Sensititre YeastOne YO10 显色药敏板两种方法完成，评估 Sensititre YeastOne 在检测非曲霉丝状真菌体外药敏的可行性。
52 株非曲霉丝状真菌收集自北京协和医院临床患者送检标本，全部菌株均经基因测序技术准确鉴定到种水平 [3]，其中根霉属 9 株 3 种、毛霉属 5 株 3 种、根毛霉属 3 株 2 种、总状共头霉 4 株、多枝横梗霉 2 株，镰刀菌属 21 株 3 种，拟青霉属 4 株 2 种，尖端赛多孢霉 4 株，共 8 个属 16 个种。
采用 Bruker AutoflexTM MALDI-TOF MS 对 52 株受试菌株进行菌种鉴定，菌株培养条件分别采用 Bruker 推荐的液体培养法和实验室常用的固体培养基培养法，其余操作均按厂家建议的标准操作程序（SOP）进行，分析软件使用 MALDI Biotyper v3.1，比对数据库选用 Bruker 丝状真菌数据库（1.0 版本）。对于液体培养组，57.7% (30/52) 菌株可经 MALDI-TOF MS 鉴定到种水平，固体培养组该数据仅为 15.4% (8/52)。
除鉴定分值因素外，分别有 88.5% (46/52) 液体培养菌株和 76.9% (40/52) 固体培养菌株的 MALDI-TOF MS 鉴定结果与测序鉴定结果一致。将 MALDI-TOF MS 种水平鉴定阈值由 ≥ 2.0 下调至 ≥ 1.7，可将固体培养菌株的种水平鉴定率提升到 67.3% (38/52)，且种水平鉴定准确率为 97.4%（37/38），这一结果可与 Bruker 推荐 SOP 鉴定率相比拟。余下未实现种水平鉴定菌株，多因 Bruker 丝状真菌数据库中缺乏对应菌种的参考质谱图。
采用 CLSI M38-A2 微量肉汤稀释法测试临床常用抗真菌药物对 52 株受试菌株的体外抗菌活性 [4]，其中两性霉素 B 表现出较好的体外抗菌活性，98.1% (51/52) 受试菌株的两性霉素 B MICs ≤ 2 µg/mL。唑类药物的体外敏感性在受试菌株中差异较大，不同种属菌株的唑类药物 MICs 分布在 0.12 µg/mL 至 16 µg/mL 不等。同时对 52 株受试菌株进行商品化 Sensititre YeastOne YO10 显色板药敏试验 [5]，评估其与 CLSI 微量肉汤稀释法在非曲霉丝状真菌药敏试验检测的一致性，除两性霉素 B 的基本一致率在两种方法间略低外（84.6%），唑类药物和棘白菌素的基本一致率均 >90%，符合 CLSI M52 评估指标 [6]，表明 Sensititre YeastOne 与 CLSI 标准方法在非曲霉丝状真菌体外药敏检测上一致性良好。
总结
综上，采用固体培养法和适当下调的种水平鉴定阈值适用于 Bruker MALDI-TOF MS 鉴定非曲霉丝状真菌；辅以不断更新扩充的质谱数据库有助于进一步提高 MALDI-TOF MS 对非曲霉丝状真菌的鉴定能力 [7]。有条件的实验室可以进行非曲霉丝状真菌药敏试验，尤其是临床考虑或已经验性应用唑类药物需要知晓菌株对唑类药物的体外敏感性时。
Sensititre YeastOne 显色药敏板在非曲霉丝状真菌体外药敏检测方面与 CLSI 标准方法一致性较好；考虑到本研究纳入菌株数及涵盖菌种数量有限，进一步扩大评估菌株代表性有助于明确 Sensititre YeastOne 在非曲霉丝状真菌药敏试验的实用性。
参考文献
[1]. Lass-Flörl C, Cuenca-Estrella M. Changes in the epidemiological landscape of invasive mould infections and disease [J]. J Antimicrob Chemother, 2017, 72(suppl_1): i5-i11.
[2]. Douglas AP, Chen SC, Slavin MA. Emerging infections caused by non-Aspergillus filamentous fungi [J]. Clin Microbiol Infect, 2016, 22(8): 670-680.
[3]. Wang H, Xiao M, Kong F, et al. Accurate and practical identifification of 20 Fusarium species by seven-locus sequence analysis and reverse line blot hybridization, and an in vitro antifungal susceptibility study [J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(5): 1890-1898.
[4]. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi [S]. Wayne, PA: CLSI 2008 document M38-A2.
[5]. Halliday CL, Chen SC, Kidd SE, et al. Antifungal susceptibilities of non-Aspergillus filamentous fungi causing invasive infection in Australia: support for current antifungal guideline recommendations [J]. Int J Antimicrob Agents, 2016, 48(4): 453-458.
[6]. Clinical and Laboratory Standards Institute. Verification of Commercial Microbial Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing Systems [S]. Wayne, PA: CLSI 2015 document M52.
[7]. Normand AC, Cassagne C, Gautie M, et al. Decision criteria for MALDI-TOF MS based identification of filamentous fungi using commercial and in-house reference databases [J]. BMC Microbiol, 2017, 17:25.