专题学术会议
CODHY——从基础到临床,探究糖尿病肾病治疗中的口服降糖药选择

相关阅读: 格列喹酮对糖尿病肾脏疾病改善作用的效果观察

格列喹酮可通过促进糖尿病Goto-Kakizaki大鼠的肾小管重吸收来降低尿蛋白水平

摘要

我们通过在糖尿病肾病 Goto-Kakizaki(GK)大鼠腹腔中植入含格列喹酮的微量渗透泵,对格列喹酮在糖尿病肾病治疗中的疗效进行了研究。每周测量一次血糖、24 小时尿蛋白、24 小时尿白蛋白水平。格列喹酮治疗进行 4 周后,利用电子显微镜,对肾小球基底膜(GBM)的病理学改变进行了观察。使用实时 PCR、免疫印迹和免疫组织化学法来检测肾小球糖基化终末产物(RAGE)(AGER)、蛋白激酶 Cβ(PKCβ)、蛋白激酶 A(PKA)受体表达以及肾小管白蛋白重吸收相关蛋白(megalin 和 cubilin)表达。使用人近端肾小管上皮细胞(HK-2 细胞)来分析格列喹酮及晚期糖基化终末产物(AGE)对 megalin 与 cubilin 表达以及对白蛋白吸收的影响。格列喹酮可降低糖尿病肾病 GK 大鼠的血糖、24 小时尿蛋白、24 小时尿白蛋白水平。接受格列喹酮治疗之后,GK 大鼠的 C-肽血浆水平明显升高,GBM 和足细胞病变也得到了显著改善。接受格列喹酮治疗后,GK 大鼠的肾小球 RAGE 和 PKCβ表达水平下降,而 PKA 表达水平则升高。AGE 显著抑制了 HK-2 细胞的体外 megalin 与 cubulin 表达以及白蛋白吸收,而在进行格列喹酮治疗后,这些细胞的体外 megalin 与 cubulin 表达以及白蛋白吸收水平均升高。总之,通过改善肾小球病变、促进肾小管重吸收,格列喹酮治疗能够有效降低糖尿病肾病 GK 大鼠的尿蛋白水平。

关键词

 

格列喹酮、糖尿病肾病、蛋白尿、机制

 

引言

 

糖尿病肾病是糖尿病(DM)最为常见的慢性并发症之一,同时也是终末期肾脏病理改变的一种主要诱因。糖尿病肾病的主要发病机理是肾小球微血管病变,但是,我们尚不明白这些病变的诱因。

现已确定晚期糖基化终末产物(AGE)是导致糖尿病性微血管病变的主要诱因。AGE 作用于肾小球毛细血管上的 AGE 受体(RAGE),激活蛋白激酶 C(PKC),启动氧化应激反应和/或造成活性氧分子(ROS)和一氧化氮大量蓄积,所有这些改变均可造成肾小球微血管内皮细胞损伤(Brownlee 2001, Kanwar et al.2008)。AGE 还可促进细胞外基质和间质细胞增生(Ziyadeh 1993)。糖尿病肾小球病变包括肾小球滤膜屏障的结构和功能改变,例如肾小球基底膜(GBM)增厚,足细胞消失(Bangstad et al. 1994, Wolf et al. 2005),从而导致蛋白排泄增多。事实上,即使糖尿病患者的尿白蛋排泄率处于正常范围以内,也不能排除肾小管已经发生病变的可能性。有研究指出,相比肾小球硬化,肾小管病变和肾间质纤维化与肾功能之间的关联更为紧密(Magri & Fava 2009)。AGE 结合 RAGE,可激活 PKC,从而增加细胞因子产量(Kanwar etal. 2008)。它们还可改变重吸收相关蛋白 megalin 和 cubilin 在上皮细胞膜表面上的表达,同时影响尿蛋白的重吸收(To jo etal. 2003, Amsellem et al. 2010)。肾小球血管病变会导致蛋白渗漏增加,肾小管病变会导致蛋白质重吸收降低,因此,这些病变是造成糖尿病肾病患者发生蛋白尿的主要病理生理学诱因(Tryggvason et al. 2006, Russo etal. 2009)。

一直以来,肾小球毛细血管中的 PKC 激活被认为是糖尿病肾病发病机理中最重要的因素,同时,实验证据表明 PKC 抑制剂能够有效预防和控制糖尿病肾病(Tuttle et al. 2005)。近来,发现糖尿病肾病发病机理与肾小球毛细血管中蛋白激酶 A(PKA)活性降低之间存在相关性。糖尿病肾病患者中的 PKC 活性增高,PKA 活性降低,因此,PKC/PKA 平衡遭到破坏。PKA 激动剂治疗也能够有效预防和/或治疗糖尿病肾病(Wang etal. 2012)。

格列喹酮是第二代磺脲类降糖药物,可促进胰腺β细胞释放内源性胰岛素,可有效降低血糖。经口服给药的格列喹酮在肠道中被快速吸收,对胰岛素分泌具有双相刺激作用。约 95% 的格列喹酮通过胆汁和粪便排泄,因此药物蓄积对于肾功能不全患者来说并不是一个问题。因此,世界卫生组织建议将格列喹酮作为存在轻度至中度肾脏病变的糖尿病肾病患者的一线药物。除了降低血糖水平,格列喹酮还可提高外周组织和肝细胞对胰岛素的灵敏度(Malaisse 2006),从而增强过氧化物酶体增殖物活化受体γ的转录活性(PPARγ; Lee et al. 2011)。Yarat et al.(2001)指出,格列喹酮可显著降低糖尿病大鼠的非酶糖化蛋白水平和总蛋白水平,同时,增加晶状体谷胱甘肽水平。Yanardag et al.(2005)报告,格列喹酮可通过降低糖尿病大鼠氧化应激水平来缓解 STZ 诱导的肝脏病变程度。糖尿病肾病患者停用口服格列喹酮并改为口服格列本脲之后,肾小球滤过率升高,尿白蛋白水平降低(Mazurov et al.1998)。

尽管一些研究表明格列喹酮可有效预防和控制糖尿病肾病,但是,我们对于这种药物改善糖尿病肾病病情的机理尚不清楚。可能的机理包括:较高血药浓度增强了格列喹酮的效应,或者,除了降低血糖水平,格列喹酮可直接作用于肾脏,从而改善糖尿病肾病病情。本研究中,我们使用能够恒速释放格列喹酮的微量渗透泵对 Goto-Kakizaki(GK)糖尿病肾病大鼠进行治疗。我们对治疗前后肾脏的病理学和功能改变进行了观察,并就格列喹酮对肾小球和肾小管表型和功能的影响进行分析,以深入阐明格列喹酮改善糖尿病肾病病情的分子机理。

材料与方法

动物模型和分组

SPF 等级 8 周龄雄性 GK 大鼠,体重约 250-300 g,购自 Shanghai Slac Laboratory Animal, Inc.(Shanghai, China)。在 12 小时光照/12 小时黑暗周期条件下喂养大鼠,大鼠可自由摄食饲料和饮用水。所有动物试均遵循中日友好医院动物伦理委员会批准的试验方案和指南予以开展。GK 大鼠摄取高脂肪饮食 2 周后,对其血糖水平进行测定;连续 3 天血糖测定水平超过 16.7 mM 的大鼠,被分入糖尿病组。然后以常规饲料连续喂养糖尿病大鼠 10 周,并测定 24 小时尿白蛋白水平。若 24 小时尿白蛋白水平超过 400 μg,则糖尿病肾病动物模型的确定即得以证实(Wang et al. 2012)。利用随机数表,将 18 只 GK 糖尿病肾病大鼠分为 3 组(每组 6 只)。格列喹酮治疗组:分别将注入 2 ml 格列喹酮溶液的 ALZET 微量渗透泵植入动物腹腔。格列喹酮溶液中含有 99.8% 二甲基甲酰胺,格列喹酮溶液的恒定释放速率为 40 nmol/kg/min。胰岛素治疗组:甘精胰岛素 2.5 IU 经皮下注射给药,每日一次。糖尿病肾病组:分别将注入 2 ml 99.8% 二甲基甲酰胺的微量渗透泵植入动物腹腔内,溶液释放速率与格列喹酮治疗组相同。试验对照物为 6 只 SPF 等级、周龄和体重(250-300 g)相似的雄性 Wistar 大鼠。所有组中的疗程均为 4 周。

测定血液中的格列喹酮浓度

为了评价微量渗透泵的输药效率,通过微量渗透泵或灌胃方式,给予大鼠格列喹酮药物(每日 10 和 50 mg/kg 体重)。利用包含荧光检测的 HPLC(高效液相色谱法)来测定大鼠血清中的格列喹酮浓度。给药一周后,对各组动物血液中的稳定药物浓度进行测定。

血糖、尿蛋白和尿白蛋白的测定

分别于第 0、1、2、3 和 4 周,对血糖、尿蛋白和尿白蛋白水平进行测定。使用血糖测量仪(Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA)对尾静脉中血糖水平进行测定。将动物置于代谢笼中,收集 24 小时尿液样品。使用 BCA 蛋白质试剂盒(Beyotime, NanTong,  China)和大鼠白蛋白 ELISA 试剂盒(Assaypro, St Charles, MO, USA)测量尿液蛋白质和尿液白蛋白水平。

血清 C-肽水平的测定

治疗 4 周后,通过腹腔注射 2.5% 戊巴比妥钠来处死动物,从静脉血液中分离血清。使用大鼠 C-肽 RIA 试剂盒(R&D, Shanghai, China)来测量 C-肽浓度。

电子显微镜

室温环境中,使用 2.5% 戊二醛固定大鼠肾脏组织 30 分钟,再利用 PBS 进行冲洗,1% 锇酸进行固定后处理。对标本进行脱水处理,包埋入 Epon812 中,制备电子显微镜切片。使用 JEM-1010 透射电子显微镜(JEOL, Tokyo, Japan)来观察 CBM 和足细胞形态。

肾小球和肾小管组织的分离

治疗 4 周后,从被处死动物体内取出两侧肾脏。对肾皮质进行均质化处理,再通过 100-网筛过滤。得到的滤液通过 300-金属网筛再次进行过滤,收集剩下的肾小球和过滤肾小管,用于后续试验。

人近端肾小管上皮细胞(HK-2 细胞)培养

将人近端肾小管上皮细胞(HK-2)置于含 10% 灭活胎牛血清、100 U/ml 青霉素、 100 U/ml 链霉素的 DMEM/F12 培养基(Sigma)内。使用 0.1% 胰蛋白酶/0.1% EDTA 进行消化处理。

将 HK-2 细胞置于含 AGE(400 μg/ml, Abcam, Cambridge, UK)、AGE(400 μg/ml)+ 胰岛素(1 IU/ml)、AGE(400 μg/ml)+ 格列喹酮(1.0 μg/ml, Double-crane Pharmaceuticals, Beijing, China)、 AGE(400 μg/ml)+LY33531(10 nM)或 AGE(400 μg/ml)+8-Br-cAMP(100 μM)的培养基内,培养 24 小时(用于实时 PCR)或 48 小时(用于白蛋白吸收和免疫印迹分析)。使用下述方法,对白蛋白重吸收和 cubilin 与 megalin 表达水平进行评估。

使用 HK-2 细胞对白蛋白吸收进行评估

将 HK-2 细胞接种于 96 孔平板内,添加 AGE、AGE+胰岛素、AGE+格列喹酮、AGE+LY33531 或 AGE+8-Br-cAMP,一同培养 48 个小时。然后再将 FITC-标记的人白蛋白(终浓度 20 μg/ml,FITC-albumin, Abcam)加入培养基中(Sidaway et al. 2004)。30 分钟之后,移除培养基,使用 PBS 冲洗细胞 4 次。然后使用连续光谱荧光酶标仪来对各个培养孔的细胞荧光强度进行测定(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)。利用 BCA 蛋白检测试剂盒,对蛋白浓度进行分析。至于细胞计数,采用总蛋白对荧光强度进行校正,测量值表达为荧光强度/μg 蛋白。

实时 PCR

使用 SV 总 RNA 分离系统(Promega),提取总 RNA,使用反转录试剂盒(Promega),将 2 μg 总 RNA 进行反转录。PCR 扩增使用 SYBR Green 实时 PCR Master Mix(Toyobo, Shanghai, China)和 ABI 7500 序列检测系统(Applied Biosystems),扩增采用三步骤方法。转录水平的相对定量使用 2﹣△△Ct 方法。PCR 扩增所用引物收录于补充材料表 1,见本文末尾所给出的补充数据(大鼠基因)以及补充材料表 2(人类基因)。

免疫印迹

使用 SDS-PAGE 来分离 100 μg 总蛋白,然后将蛋白质转移至 PVDF 膜上。免疫印迹分别使用了小鼠抗肌动蛋白抗体(Sigma)、小鼠抗 RAGE 抗体(Sigma)、小鼠抗大鼠/人 PKCβ抗体(Sigma)、兔抗小鼠/人 PKA 抗体(Abcam)、鼠类抗大鼠 megalin 抗体(Abcam)、羊抗大鼠 cubilin 抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)、兔抗人 megalin 抗体(Abcam)、羊抗人 cubilin 抗体(Santa Cmz Biotechnology, Inc.)。检测使用 ECL(Millipore, Shanghai, China)。

免疫组织化学染色

使用 10% 中性甲醛固定大鼠胰腺组织,制备石蜡包埋切片,以评估糖尿病组和格列喹酮组的胰岛素水平。使用兔抗大鼠胰岛素抗体和 HRP 标记的第二抗体对切片进行免疫染色。与 DAB 底物发生反应并对细胞核进行再次进行染色后,于光学显微镜(Olympus,Tokyo, Japan)下观察切片并拍照。

使用 10% 中性甲醛固定大鼠肾脏,制备石蜡包埋切片,以评价格列喹酮对蛋白重吸收的影响。使用小鼠抗大鼠 RAGE 抗体、小鼠抗大鼠 PKCβ抗体、兔抗大鼠 PKA 抗体、小鼠抗大鼠 megalin 抗体、羊抗小鼠 cubilin 抗体,对切片进行免疫染色。使用 PBS 对切片进行冲洗,然后添加 HRP 标记的第二抗体。与 DAB 底物发生反应并对细胞核再次染色后,于光学显微镜(Olympus)下观察切片并拍照。

细胞的免疫荧光染色

将 HK-2 细胞接种于 96 孔培养板,添加 AGE(400 μg/ml)或 AGE(400 μg/ml)+ 格列喹酮(1 μg/ml),共同培养 48 小时。使用 PBS 洗涤细胞,使用 4% 多聚甲醛进行固定,使用 1% BSA/0.02% Tween 进行封闭。免疫染色分别以小鼠抗人 RAGE 抗体、小鼠抗人 PKCβ抗体、兔抗人 PKA 抗体、兔抗人 megalin 抗体、羊抗人 cubilin 抗体为第一抗体,以 Alexa fluor 488 共轭抗体为第二抗体。在荧光显微镜下观察结果并拍照。

统计学分析

数据表达为均值±SD。使用软件 SPSS 17.0 进行统计学分析。单因素方差分析用于组间数据比较。P<0.05 与 P<0.01 指示统计显著性。

结果

微量渗透泵给药后的格列喹酮血药浓度

治疗一周后,泵给药组动物的格列喹酮平均血清浓度大约是灌胃给药组动物的 5 倍,10 mg/kg 组和 50 mg/kg 组均是如此。此外,50 mg/kg 组动物的格列喹酮血清浓度为 10 mg/kg 组动物的 5 倍。因此,使用微量渗透泵腹腔给药得到的格列喹酮血药浓度较高。


图 1
微量渗透泵给药后的格列喹酮血药浓度。格列喹酮治疗开始 1 周后,采集血清样品,使用包含荧光检测的 HPLC 测定格列喹酮浓度。灌胃给药:GK 大鼠接受格列喹酮灌胃给药,每日一次,剂量与微量渗透泵组大鼠所使用剂量相同。微量渗透泵:利用植入腹腔的微量渗透泵对 GK 大鼠进行格列喹酮给药。10 mg:药物剂量为 10 mg/kg 体重;50 mg:药物剂量为 50 mg/kg 体重。

格列喹酮对血糖和蛋白尿的影响

治疗期间,格列喹酮组和胰岛素组动物的血糖水平均显著下降(图 2A)。糖尿病肾病组和胰岛素组动物的 24 小时尿蛋白和尿白蛋白水平升高。然而,在格列喹酮组,24 小时尿蛋白水平(图 2B)并未升高,24 小时尿白蛋白水平(图 2C)缓慢升高。治疗开始 2 周后,糖尿病肾病组和格列喹酮组之间的 24 小时尿蛋白和白蛋白水平出现了显著差异(P<0.01)。

格列喹酮对大鼠胰岛细胞的胰岛素分泌与 C-肽分泌的影响

糖尿病肾病组动物的胰岛素染色水平显著低于正常组。然而,格列喹酮组动物的胰岛素染色水平升高,接近正常水平(图 3A)。此外,糖尿病肾病组动物的 C-肽血清浓度显著低于对照组,但是,格列喹酮组动物的 C-肽血清浓度则显著高于糖尿病肾病组动物(图 3B)。

格列喹酮对 GBM 和足细胞形态的影响

与正常对照组相比,糖尿病肾病 GK 组大鼠 GBM 明显增厚,足细胞足突受压或缺失,排列混乱。经过 4 周格列喹酮治疗后,GBM 显著变薄,足细胞足突形态和排列得到改善,类似于正常组。然而,经过 4 周胰岛素治疗后,GBM 形态和足突与糖尿病肾病组并无明显差异(图 4)。


图 2
格列喹酮对糖尿病 GK 大鼠尿白蛋白排泄率的影响。(A)格列喹酮对糖尿病 GK 大鼠血糖水平的影响。(B)格列喹酮对糖尿病 GK 大鼠尿蛋白水平的影响。(C)格列喹酮对糖尿病 GK 大鼠尿白蛋白水平的影响。Normal,正常大鼠;DN,接受生理盐水治疗的糖尿病肾病 GK 大鼠;DN + Gli,接受格列喹酮治疗的糖尿病肾病 GK 大鼠;DN + insulin,接受胰岛素治疗的糖尿病肾病 GK 大鼠。*P<0.05,**P<0.01 DN + Gli 组对比 DN 组。


图 3       
格列喹酮对胰岛中的胰岛素表达以及血清 C 肽水平的影响。(A)格列喹酮对胰岛中胰岛素表达的影响。(B)格列喹酮对糖尿病大鼠血清 C 肽水平的影响。Normal,正常大鼠;DN,接受生理盐水治疗的糖尿病肾病 GK 大鼠;DN + Gli,接受格列喹酮治疗的糖尿病肾病 GK 大鼠。**P<0.01 对比 DN 组。

格列喹酮对 HK-2 细胞白蛋白吸收的影响

培养后的 HK-2 细胞能够吸收培养基中的 FITC-标记的人白蛋白。与 AGE 共同孵育之后,HK-2 细胞胞内荧光强度低于对照组。格列喹酮组荧光强度高于 AGE 组(图 5A 和 5B)。格列喹酮以剂量依赖方式导致白蛋白细胞吸收量增高(图 5C)。

格列喹酮对肾小管和 HK-2 细胞 megalin 与 cubilin 表达的影响

糖尿病肾病组动物肾小管组织中 megalin 与 cubilin 表达水平低于对照组动物(图 6A、6B 和 6C)。经过 4 周格列喹酮治疗之后,肾小管 megalin 与 cubilin 的表达水平上调。

AGE 处理过的 HK-2 细胞中 megalin 与 cubilin 的表达水平低于正常对照细胞。然而,格列喹酮似乎能够抑制 AGE 的作用,这一点可从 AGE+格列喹酮组 megalin 与 cubilin 的正常表达水平得到印证(图 6D、6E 和 6F)。

格列喹酮对肾小球 RAGE、PKCβ和 PKA 表达的影响

与对照组动物相比,糖尿病肾病 GK 大鼠中 RAGE 和 PKCβ的肾小球表达上调,而 PKA 表达则显著降低。与糖尿病肾病组相比,格列喹酮组 RAGE 和 PKCβ表达下降,PKA 表达升高(图 7A、7B 和 7C)。

格列喹酮对肾小管和 HK-2 细胞 megalin 与 cubilin 表达的影响

三个组中的肾小管组织 RAGE、PKCβ和 PKA 水平的改变与肾小球组织相似。与正常对照组相比,糖尿病肾病 GK 组大鼠 RAGE 和 PKCβ的肾小管表达升高,而 PKA 表达则显著下降,具体包括 mRNA、蛋白质和组织染色水平(图 8A、8B 和 8C)。与糖尿病肾病组相比,格列喹酮组肾小管 RAGE 和 PKCβ表达下降,PKA 表达升高。


图 4
格列喹酮对 GBM 和足细胞足突结构的影响。Normal,正常大鼠;DN,接受生理盐水治疗的糖尿病肾病 GK 大鼠;DN + Gli,接受格列喹酮治疗的糖尿病肾病 GK 大鼠;DN + insulin,接受胰岛素治疗的糖尿病肾病 GK 大鼠。

 


图 5       
格列喹酮对 HK-2 细胞白蛋白吸收的影响。(A)显微镜下观察结果表明 HK-2 细胞吸收 FITC-标记的人白蛋白。(B)吸收定量分析,即荧光酶标仪测定的荧光强度以及经总蛋白校正的细胞数量的定量分析。(C)格列喹酮对白蛋白吸收的剂量效应。全部试验均重复三次。为每个组设定 4 个微孔。**P<0.01 对比 AGE 组。

 

与正常对照组相比,AGE 组 HK-2 细胞的 RAGE 和 PKCβ表达水平升高,而 PKA 表达水平则降低。与 AGE 组相比,AGE + 格列喹酮组 AGE 和 PKCβ表达水平下调,PKA 表达水平上调(图 8D、E 和 F)。

PKC 抑制剂和 PKA 激动剂对 HK-2 细胞白蛋白吸收功能和 megalin 与 cubilin 表达的影响

由于 AGE 和格列喹酮可影响白蛋白吸收及 PKC 和 PKA 表达,因此,我们使用 PKC 抑制剂 LY333531 和 PKA 激活剂 8-Br-cAMP,就 PKC 和 PKA 对 HK-2 细胞白蛋白吸收功能和 megalin 与 cubilin 表达的影响进行了研究。结果表明,AGE 处理过的 HK-2 细胞中的白蛋白吸收下降,可通过 HK-2 细胞与格列喹酮、LY333531 或 8-Br-cAMP 的共同孵育所逆转,但 HK-2 细胞与胰岛素的共同孵育则不具有这种效应(图 9A)。AGE 处理过的 HK-2 细胞中的 megalin 与 cubilin 的表达下降,也可通过格列喹酮、LY333531 或 8-Br-cAMP 逆转,但不能被胰岛素逆转(图 9B 和 9C)。

讨论

糖尿病肾病是糖尿病最为严重的并发症之一。然而,我们仍不太清楚糖尿病肾病的发病机制,同时,对于糖尿病肾病,目前尚无有效的专用药物治疗可供选择。因此,近年来,研究者一直致力于探索能够有效治疗糖尿病肾病的药物。

本研究中,我们发现格列喹酮能够显著降低糖尿病肾病 GK 大鼠的尿蛋白水平,减轻糖尿病肾病病变程度。格列喹酮治疗所带来的糖尿病肾病病情的改善与肾小球滤过率和肾小管白蛋白重吸收的改善密切相关。这些结果为格列喹酮预防和治疗糖尿病肾病的设想提供了支持性证据。

糖尿病引发的微血管病变被认为是糖尿病肾病的主要诱因之一。葡萄糖代谢发生紊乱条件下,AGE 产量增加;AGE 作用于肾小球毛细血管受体(即,RAGE),通过激活 PKC,促进氧化应激,


图 6
格列喹酮对糖尿病大鼠肾小管和 HK-2 细胞中的 megalin 与 cubilin 表达的影响。(A)使用实时 PCR(A)、免疫印迹法(B)、免疫组织化学法(C),对肾小管组织中 megalin 与 cubilin 的表达进行评价。使用实时 PCR(D)、免疫印迹法(E)、免疫组织化学法(F),对 HK-2 细胞中 megalin 与 cubilin 的表达进行评价。*P<0.05,**P<0.01 对比 DN 组。

从而导致 ROS 和 NO 的蓄积,最终造成肾小球毛细血管内皮细胞损伤。有研究指出 PKC 通过促进细胞因子激活、细胞外基质生长、细胞生长和增生、血管生成、血管收缩与舒张、血管通透性改变,在糖尿病肾病的发病机制中起作用(Noh & King 2007, Geraldes & King 2010)。PKC 家族中的异构体 PKCβ对糖尿病肾病的发生和发展所起到的作用最大(Meier et al.2009, Geraldes & King 2010)。PKCβ的过度表达导致 TGF-β表达上调,从而引发细胞外基质的沉积,进而导致肾小球硬化和肾小管纤维化(Koya et al. 1997, Slattery et al. 2008, Wu et al. 2009)。此前进行的多项研究表明,通过敲除 PKCβ(Prkcb)基因或使用 PKCβ抑制剂,可推迟糖尿病肾病的进展。目前一般认为,PKC 激活可诱发糖尿病肾病,而 PKC 抑制则可阻遏糖尿病肾病发生(Noh & King 2007)。最近,我们发现 PKA 活性也与糖尿病肾病的发生密切相关。使用 PKA 激动剂能够控制或改善糖尿病肾病(Wang et al. 2012)。

本研究中,我们发现接受格列喹酮治疗后的糖尿病肾病大鼠的微血管病变程度显著下降。具体表现为:肾小球毛细血管 RAGE 表达下调,PKC 活性降低,PKA 活性升高。此外,GBM 厚度降低,足细胞的形态和分布得到改善。生物化学分析表明,24 小时尿蛋白和 24 小时尿白蛋白水平显著降低,提示格列喹酮提高了肾小球滤过率。

有报告指出,胰岛移植可预防或逆转糖尿病微血管病变,延迟受体尿蛋白增多的发生(Fiorina et al. 2003, 2005)。近来研究表明,胰岛细胞所产生的 C-肽有助于预防和治疗糖尿病微血管病变(Cotter et al. 2003,Forst & Kunt 2004,Hillset al. 2010)。事实上,多项人体试验和动物研究表明,C-肽可改善糖尿病肾病的肾脏结构和功能异常(Hills et al. 2010)。Samnegard et al.(2005)报告中指出,与接受安慰剂治疗的糖尿病肾病大鼠相比,接受 C-肽治疗的大鼠的蛋白尿和系膜基质合成量显著下降。本研究中,我们发现格列喹酮可升高糖尿病 GK 大鼠 C-肽血浆水平(图 3B)。这可能是格列喹酮改善糖尿病肾病的诸多途径之一。


图 7
格列喹酮对糖尿病大鼠肾小球 RAGE、PKCβ和 PKA 表达的影响。使用实时 PCR(A)、免疫印迹法(B)和免疫组织化学染色法(C),对肾小球组织中的 megalin 与 cubilin 表达水平进行评价。*P<0.05,**P<0.01 对比 DN 组。


图 8
格列喹酮对糖尿病大鼠肾小管和 HK-2 细胞中的 RAGE、PKCβ和 PKA 表达的影响。使用实时 PCR(A)、免疫印迹法(B)、免疫组织化学法(C),对肾小管组织中 RAGE、PKCβ和 PKA 的表达进行评价。使用实时 PCR(D)、免疫印迹法(E)、免疫组织化学法(F),对 HK-2 细胞中 RAGE、PKC 和 PKA 的表达进行评价。*P<0.05,**P<0.01 对比 AGE 组。

蛋白尿是糖尿病肾病的一种主要临床表现,与肾脏病变程度密切相关(Araki et al. 2008)。肾小球滤过屏障的结构改变和肾小管蛋白重吸收是导致发生糖尿病肾病蛋白尿的主要病理生理学决定因素。GBM 和足细胞改变会破坏肾小球滤过屏障。进行格列喹酮治疗后,GBM 和足细胞病变明显改善,这可能是导致格列喹酮治疗过程中观察到尿蛋白和白蛋白水平降低的一种原因。

肾小管蛋白重吸收量降低是造成糖尿病肾病蛋白尿的另一种主要诱因(Russo etal. 2009)。已知肾小管上皮细胞表面可表达 RAGE,而 RAGE 可与 AGE 结合。AGE 可通过 RAGE 诱发氧化应激,具体机制包括产生大量 ROS,激活肾素-血管紧张素系统,与信号分子如 PKC 和核因子κB(NF-κB)相互作用,造成肾小管间质纤维化(Yamagishi & Matsui 2010)。近端肾小管是重吸收的主要部位,对糖尿病相关代谢产物及活化因子特别敏感。因此,近端肾小管上皮细胞改变可诱发糖尿病肾病肾小管病变。本研究中,糖尿病肾病大鼠近端肾小管 RAGE 表达上调,PKC 活性增高,PKA 活性降低。接受格列喹酮治疗的糖尿病肾病大鼠中,近端肾小管 RAGE 表达下调,PKC 活性和 PKA 活性恢复正常。此外,我们还证实 AGE 的确是造成 HK-2 细胞表型改变的主要诱因,还发现格列喹酮可逆转这些改变。


图 9
PKC 抑制剂和 PKA 激动剂对 HK-2 细胞的白蛋白吸收功能和 megalin 与 cubilin 表达的影响。(A)LY333531(PKC 抑制剂)和 8-Br-cAMP(PKA 激活剂)对 HK-2 细胞白蛋白吸收的影响*P<0.01,对比对照组;#P<0.01 对比 AGE 组。(B)使用实时 PCR 评估 LY333531 和 8-Br-cAMP 对 HK-2 细胞中 megalin 和 cubilin 表达的影响。(B)使用免疫印迹法评估 LY333531 和 8-Br-cAMP 对 HK-2 细胞中 megalin 和 cubilin 表达的影响。

近端肾小管上皮细胞白蛋白重吸收通过两种受体蛋白(megalin 与 cubilin)的作用得以实现(Verroust etal. 2002)。这些蛋白表达改变可影响白蛋白重吸收(Hosojima et al. 2009, Cabezas et al. 2011)。本研究中,糖尿病肾病 GK 大鼠近端肾小管中 megalin 与 cubilin 的表达显著下调,但是,接受格列喹酮治疗后,megalin 与 cubilin 的表达又恢复正常。使用 HK-2 细胞进一步证实了以上研究结果。我们的研究结果表明,AGE 通过下调 megalin 与 cubilin 表达水平,降低白蛋白摄取量,而格列喹酮通过上调 megalin 与 cubilin 表达水平,以剂量依赖方式增加白蛋白摄取量。我们的结果支持格列喹酮通过增加肾小管白蛋白重吸收量,从而达到降低糖尿病肾病尿蛋白水平的目的这一思路。

应当指出的是,通过微量渗透泵方式实现格列喹酮给药的疗效,可能不同于口服给药。其中,使用微量渗透泵获得的血浆浓度可能较高。如果的确如此,格列喹酮的肾脏排泄率将升高,而对肾小球和肾小管的效应将变得更为明显。格列喹酮主要通过门静脉系统进行代谢,因此,口服给药时的血浆浓度较低。事实上,口服给药后,肾脏排泄浓度估计仅为总浓度的 5%。因此,通过格列喹酮口服给药,可能难于达到控制糖尿病肾病、降低尿蛋白水平的目的。

我们的结果表明,格列喹酮可通过改善糖尿病肾病 GK 大鼠的肾小球病变、促进肾小管重吸收有效降低尿蛋白水平。格列喹酮有可能成为糖尿病肾病的一种有效治疗药物,但是,必需考虑到微量渗透泵给药与口服给药之间的药代动力学特征的差异。

补充资料

有关本论文的在线版本请点击链接:http://dx.doi.org/10.1530/ JOE-13-0199。

申报利益

本论文作者们声明不存在可能会有损所报告研究公正性的利益冲突。

资金支持

本研究资金提供单位:中国国家基础研究计划(2012CB966402);关键新药研发与生产计划(编号:2011ZX09102-010-03 以及国家自然科学基金委员会(编号:81370873 和 81302334)。

参考文献

1. Amsellem S, Gburek J, HamardG,Nielsen R,Willnow TE, DevuystO,Nexo E, Verroust PJ, Christensen EI & Kozyraki R 2010 Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology 21 1859–1867. (doi:10.1681/ASN. 2010050492)

2. Araki S, Haneda M, Koya D, Kashiwagi A, Uzu T & Kikkawa R 2008 Clinical impact of reducing microalbuminuria in patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice 82(Suppl 1) S54–S58. (doi:10.1016/j.diabres.2008.09.031)

3. BangstadHJ, Dahl-Jørgensen K, Hanssen K, Østerby R, Berg K&Hartmann A 1994 Improvement of blood glucose control in IDDM patients retards the progression of morphological changes in early diabetic nephropathy. Diabetologia 37 483–490. (doi:10.1007/s001250050136)

4. Brownlee M 2001 Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414 813–820. (doi:10.1038/414813a)

5. Cabezas F, Lagos J, Cespedes C, Vio CP, Bronfman M & Marzolo MP 2011 Megalin/LRP2 expression is induced by peroxisome proliferatoractivated receptor-a and -g: implications for PPARs』 roles in renal function. PLoS ONE 6 e16794. (doi:10.1371/journal.pone.0016794)

6. Cotter MA, Ekberg K, Wahren J & Cameron NE 2003 Effects of proinsulin C-peptide in experimental diabetic neuropathy: vascular actions and modulation by nitric oxide synthase inhibition. Diabetes 52 1812–1817. (doi:10.2337/diabetes.52.7.1812)

7. Fiorina P, Folli F, Bertuzzi F,Maffi P, Finzi G, VenturiniM, Socci C, Davalli A, Orsenigo E, Monti L et al. 2003 Long-term beneficial effect of islet transplantation on diabetic macro-/microangiopathy in type 1 diabetic kidney-transplanted patients. Diabetes Care 26 1129–1136. (doi:10.2337/diacare.26.4.1129)

8. Fiorina P, Venturini M, Folli F, Losio C, Maffi P, Placidi C, La Rosa S, Orsenigo E, Socci C, Capella C et al. 2005 Natural history of kidney graft survival, hypertrophy, and vascular function in end-stage renal disease type 1 diabetic kidney-transplanted patients: beneficial impact of pancreas and successful islet cotransplantation. Diabetes Care 28 1303–1310. (doi:10.2337/diacare.28.6.1303)

9. Forst T & Kunt T 2004 Effects of C-peptide on microvascular blood flow and blood hemorheology. Experimental Diabesity Research 5 51–64. (doi:10.1080/15438600490424532)

10. Geraldes P & King GL 2010 Activation of protein kinase C isoforms and its impact on diabetic complications. Circulation Research 106 1319–1331. (doi:10.1161/CIRCRESAHA.110.217117)

11. Hills CE, Brunskill NJ & Squires PE 2010 C-peptide as a therapeutic tool in diabetic nephropathy. American Journal of Nephrology 31 389–397. (doi:10.1159/000289864)

12. HosojimaM, SatoH,Yamamoto K, Kaseda R, Soma T, Kobayashi A, Suzuki A, Kabasawa H, Takeyama A, Ikuyama K et al. 2009 Regulation of megalin expression in cultured proximal tubule cells by angiotensin II type 1A receptor- and insulin-mediated signaling cross talk. Endocrinology 150 871–878. (doi:10.1210/en.2008-0886)

13. Kanwar YS, Wada J, Sun L, Xie P, Wallner EI, Chen S, Chugh S & Danesh FR 2008 Diabetic nephropathy: mechanisms of renal disease progression. Experimental Biology and Medicine 233 4. (doi:10.3181/0705-MR-134)

14. Koya D, Jirousek MR, Lin YW, Ishii H, Kuboki K & King GL 1997 Characterization of protein kinase C b isoform activation on the gene expression of transforming growth factor-b, extracellular matrix components, and prostanoids in the glomeruli of diabetic rats. Journal of Clinical Investigation 100 115–126. (doi:10.1172/ JCI119503)

15. Lee KW, Ku YH, Kim M, Ahn BY, Chung SS & Park KS 2011 Effects of sulfonylureas on peroxisome proliferator-activated receptor g activity and on glucose uptake by thiazolidinediones. Diabetes & Metabolism Journal 35 340–347. (doi:10.4093/dmj.2011.35.4.340)

16. Magri CJ & Fava S 2009 The role of tubular injury in diabetic nephropathy. European Journal of Internal Medicine 20 551–555. (doi:10.1016/j.ejim. 2008.12.012)

17. Malaisse WJ 2006 Gliquidone contributes to improvement of type 2 diabetes mellitus management: a review of pharmacokinetic and clinical trial data. Drugs in R&D 7 331–337. (doi:10.2165/00126839- 200607060-00002)

18. Mazurov VI, Novik AA, Nagibovich OA, Romashevskii BV, Guliaeva IV & Kurganova TA 1998 Effect of sugar-reducing therapy on renal function in patients with type II diabetes mellitus. Klinicheskaia Meditsina 76 38–41.

19. Meier M, Menne J & Haller H 2009 Targeting the protein kinase C family in the diabetic kidney: lessons from analysis of mutant mice. Diabetologia 52 765–775. (doi:10.1007/s00125-009-1278-y)

20. Noh H & King GL 2007 The role of protein kinase C activation in diabetic nephropathy. Kidney International 72(Suppl) S49–S53. (doi:10.1038/sj.ki.5002386)

21. Russo LM, Sandoval RM, Campos SB,Molitoris BA, ComperWD& Brown D 2009 Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology 20 489. (doi:10.1681/ASN.2008050503)

22. Samnegard B, Jacobson SH, Jaremko G, Johansson BL, Ekberg K, Isaksson B, Eriksson L,Wahren J & Sjoquist M 2005 C-peptide prevents glomerular hypertrophy and mesangial matrix expansion in diabetic rats. Nephrology, Dialysis, Transplantation 20 532–538. (doi:10.1093/ndt/ gfh683)

23. Sidaway JE, Davidson RG, McTaggart F, Orton TC, Scott RC, Smith GJ & Brunskill NJ 2004 Inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase reduce receptor-mediated endocytosis in opossum kidney cells. Journal of the American Society of Nephrology 15 2258–2265. (doi:10.1097/01.ASN.0000138236.82706.EE)

24. Slattery C, RyanMP & McMorrow T 2008 Protein kinase C b overexpression induces fibrotic effects in human proximal tubular epithelial cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology 40 2218–2229. (doi:10.1016/j.biocel.2008.03.005)

25. Tojo A, Onozato ML, Kurihara H, Sakai T, Goto A & Fujita T 2003 Angiotensin II blockade restores albumin reabsorption in the proximal tubules of diabetic rats. Hypertension Research 26 413–419. (doi:10.1291/hypres.26.413)

26. Tryggvason K, Patrakka J & Wartiovaara J 2006 Hereditary proteinuria syndromes and mechanisms of proteinuria. New England Journal of Medicine 354 1387–1401. (doi:10.1056/NEJMra052131)

27. Tuttle KR, Bakris GL, Toto RD, McGill JB, Hu K & Anderson PW 2005 The effect of ruboxistaurin on nephropathy in type 2 diabetes. Diabetes Care 28 2686–2690. (doi:10.2337/diacare.28.11.2686)

28. Verroust PJ, Birn H, Nielsen R, Kozyraki R & Christensen EI 2002 The tandem endocytic receptors megalin and cubilin are important proteins in renal pathology. Kidney International 62 745–756. (doi:10.1046/j.1523-1755.2002.00501.x)

29. Wang H, Jiang YW, Zhang WJ, Xu SQ, Liu HL, Yang WY & Lou JN 2012 Differential activations of PKC/PKA related to microvasculopathy in diabetic GK rats. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism 302 E173–E182. (doi:10.1152/ajpendo.00184.2011)

30. Wolf G, Chen S & Ziyadeh FN 2005 From the periphery of the glomerular capillary wall toward the center of disease: podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy. Diabetes 54 1626–1634. (doi:10.2337/diabetes.54.6.1626)

Wu D, Peng F, Zhang B, Ingram AJ, Kelly DJ, Gilbert RE, Gao B & Krepinsky JC 2009 PKC-b1 mediates glucose-induced Akt activation and TGF-b1 upregulation in 

95
最新评论