SU前沿速递

【胰岛β细胞专题】内外结合,胰岛功能体外评估方法详解

 

编者按:继上个专题为大家介绍了β细胞功能的评估指标与方法,这期专题我们主要集中在β细胞治疗新技术方面。目前,在动物模型中对胰岛β细胞功能的评估并不仅限于活体内,除葡萄糖耐量试验等体内评估技术外,胰岛表面灌注及离体胰腺灌注技术等体外评估技术也逐步应用,今天我们就将为大家详细介绍胰岛功能的体外评估方法。

l  胰腺灌流

1966 年,大鼠胰腺灌流方法由 Sussman 等学者首次建立,并先后由 Assan、Giroix 等进行了改进和完善,此后广泛应用于大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌动力学研究。下面是具体的操作流程:

1.     胰腺分离:实验前各组大鼠自由摄食饮水,戊巴比妥钠 (50 mg/kg,ip) 麻醉下取出胰脏。双重结扎肠系膜动脉并剪断、分离,取出十二指肠以下的全部肠管以充分暴露。需尽可能高的结扎食管,并在结扎线上端剪开;另一未打结的结扎线环绕胃环肝系膜,在腹中线端点上、膈肌根部小心暴露主动脉,然后系紧胃肝系膜上的结扎线,并于结扎上方剪断系膜。在双重钳夹之间及下面钳子的下方剪断主动脉,从腹腔取出胰脏。放开对着腹中线起端主动脉切口上的夹子,露出主动脉口,插入动脉插管,在适当的位置扎紧,使开口靠近结扎线,并靠近门脉末端。

2.     灌流:开始灌流,观察液体从门静脉口流出。1~2 min 后,停止灌流,进行门静脉插管,以备收集灌流液。随后恢复灌流,保持灌流压力约为 100 mmHg。灌流温度为 37.5 ℃,灌流速度 1.75 mL/min。分别收集每分钟的灌流液,共收集 30 min,-20 ℃ 保存,待查胰岛素含量。

胰腺灌流 1

l  胰岛灌流 2 

目前在国内基础研究中,针对动物模型所采用的胰岛β细胞功能评估方法大多为分离胰岛后,给予高糖/低糖刺激,并取其上清液测定胰岛素浓度。这种方法反映了给予葡萄糖负荷后一定时间内,分泌的胰岛素总量,但不能同时反映胰岛素在分泌时相和分泌数量方面的变化,且无法探究节律。而胰岛灌流可以从分泌时相和分泌数量两个方面评价胰岛素分泌功能,更准确的评估胰岛功能。下面是具体的操作流程:

1.    建立离体胰岛灌流系统 3 :

离体胰岛灌流系统

2.     灌流准备:胰岛分离后置于 Hanks 平衡液中,于二氧化碳孵箱 38 ℃ 下孵育 1 h,并将胰岛按每组 50 个进行分组。将离体胰岛灌流系统置于 37 ℃ 下水浴,并将微最泵输注系统与其连接。随后将预先配置好的低糖灌流液充填至整个管道系统,在层析柱中加入葡聚糖凝胶,然后将每组 50 个胰岛转移至层析柱,再加入 100 ul 葡聚糖凝胶。最后将整个管道系统全部浸入水浴。

3.     灌流:开始时用低糖灌流液以 0.5 ml/h 的速度灌流 1 h,随后换为高糖灌流液以 1 ml/h 的速度灌流,并以开始高糖灌流时为 0 时间点,分别于灌流前 30、20、10 min、灌流后 0、20、40、60、80、100 s 和 2、3、4、5、7、8、9、10、15、20、25、30 min 收集灌流出的液体,-80 ℃ 下保存,随后测定胰岛素含量,并根据胰岛素浓度绘制胰岛素第一时相分泌曲线。

这些体外评估方法由于排除了体内多种因素的干扰,能够较准确地评估胰岛β细胞功能,是研究动物模型不同病理生理状态下胰岛β细胞胰岛素分泌能力变化及机制、以及各种营养物质和药物对胰岛β细胞功能影响及其作用机制的重要手段。

1.  赵乃倩, 余叶蓉, 谭惠文, 等. 大鼠胰腺离体灌注技术的建立. 中华内分泌杂志 2007,23(5):459-463

2.  邵加庆, 顾萍, 杜宏, 等. 建立离体胰岛灌流系统用于评估胰岛素第一时相分泌功能. 中华医学杂志 2010,90(2):119-122

3. Cejvan K, Coy DH, Holst JJ, Cerasi E, Efendic S. Diabetes 2002,51 Suppl 3:S381-S384

 

65
您可以对本篇文章进行评级
专业性
实用性

评论区