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降糖药格列美脲作为一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的动力学和 分子对接研究:对阿尔茨海默病和糖尿病双重治疗的意义

1 研究背景 


目前全球有数百万老年人正在受到一种渐进性神经退行性脑病——阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease, AD) 的折磨。遗憾的是,由于缺乏有效的治疗选择,预计到 2050 年这一数字将超过 7 千万。AD 是一种复杂的综合征,其病因包括多种因素,如β-淀粉样蛋白聚集、 tau 蛋白聚集和乙酰胆碱水平降低等。胆碱能神经传递障碍和 AD 之间的关联为将乙酰胆碱酯酶 (activity of acetylcholine esterase,AChE) 抑制剂开发为治疗药物提供了理论基础。AChE 的主要功能为分解乙酰胆碱和终止胆碱能突触部位的神经冲动传递,还可增强脑中老年性β-淀粉样蛋白斑块的沉积。研究显示,使用 AChE 抑制剂可缓解 AD 的一些行为和认知症状。

目前已有多种 AChE 抑制剂被用于治疗 AD,如多奈哌齐、加兰他敏、他克林和石杉碱甲。这些药物可在一定程度上延缓 AD 患者的神经退行性变,但非对因治疗。目前已为开发更有效的 AD 治疗药物进行了大量工作。另一方面,流行病学研究为 2 型糖尿病 (rype 2 diabetes mellitus, T2DM) 和 AD 之间存在显著关联提供了证据。与 AD 相同, T2DM 也是一种常见的退行性疾病,患病率随年龄增长而增高。一些临床和病理学数据也提示 T2DM 与 AD 之间可能存在关联。糖尿病的高血糖和胰岛素功能异常可能会对记忆力、
 

神经突触可塑性和学习能力造成影响,进而导致 AD。还有一些报告提示 T2DM 是发生 AD 的重要风险因素。 T2DM 与 AD 有一些共同的风险因素,包括氧化应激、代谢异常、胆固醇升高、心血管疾病、退行性变、 β-淀粉样蛋白沉积和τ蛋白磷酸化。目前, T2DM 和 AD 这两种可能相互关联的渐进性退行性疾病造成的负担正在不断加重,开发双重治疗药物 (治疗一种疾病的药物也可有效用于治疗相关联的疾病) 的理念有利于国计民生,但目前基于这一理念的文献非常有限。
 

2 研究目的 


本研究的目的是检验降糖药 (格列美脲) 能否作为一种 AChE 抑制剂。我们在近期发表的关于降糖药达格列净和卡格列净的文章中成功发现了 AD 与 T2DM 的关联以及可能的双重治疗,但当时尚未进行抑制作用的实验性动力学研究。由于目前尚无关于降糖药格列美脲对人脑 AChE 抑制效应的明确证据,故探索其抑制效力和解释其与 AChE 结合的分子学基础非常有意义。我们进行了体外酶动力学研究和电脑模拟的分子对接研究,目的是尝试探索格列美脲作为 AChE 强抑制剂的活性,并阐明可能的作用机制。我们坚信这项研究将有助于科学家对多效用 AChE 抑制剂的药物设计。并且,单一化合物可能提供双重抑制作用的意义将有助于开发抗阿尔茨海默病和糖尿病双重作用的新药。
 

3 研究方法 


3.1 乙酰胆碱酯酶活性 基于 Ingkaninan 等描述的方法测定酶的活性。在 3m l 比色皿中加入 D T N B1000μl(3 mM)、 AChI 200μl(15 mM)、 Tris–HCl 缓冲液 700μl(50 mM/pH 8) 和不同浓度的格列美脲溶液 100μl,将比色皿用作空白对照。在反应比色皿中,用相同体积含 0.28U/ml AChE 酶的溶液代替 50μl 缓冲液。于 405nm 处监测光谱反应 10 分钟。给出的数据为三次重复测定的平均值。在此,将格列美脲溶解于最小浓度的 DMSO。使用以下公式计算胆碱酯酶活性的抑制百分率:% 抑制百分率 =(Δ对照吸光度)-(Δ药物吸光度)×100×(Δ对照吸光度)

3.2 动力学测定 37℃ 下使用五种浓度 (1、 2、 5、 10 和 15 mM) 的碘化乙酰胆碱进行格列美脲对抗 AChE 的酶动力学研究,格列美脲包括空白和四种不同浓度 (100、 150、 200 和 250μM),于 405nm 处通过光谱测定描述 AChE 催化的 AChI 水解动力学特征。每间隔 1 分钟读取一次 OD 数值,共监测 10 分钟,将数据描记在 Lineweaver-Burk 图上,分析抑制机制。
 

3.3 分子对接研究 从蛋白质数据库 (PDB ID: 3LII) 中提取存在于载脂蛋白形式中的人脑 A C h E 的三维结构,并用于当前的对接研究。从 P u b C h e m 数据库中获取配体格列美脲 (C I D: 3476) 和底物 AChI(CID: 75271) 的结构。为了达到配体分子的能量最小化,使用 MMFF94 力场。在配体原子中加入 Gasteiger 偏电荷。将非极性氢原子合并,并确定可旋转键。在蛋白质分子上进行对接计算。在 AutoDock 工具的帮助下追加基本氢原子、 Kollman 联合型原子电荷和溶解参数。在自动网格程序的帮助下生成 60×60×60 Å网格点的亲和度 (网格) 图,目的是锁定在 AChE 催化位点 (catalytic site, CAS) 的阴离子亚位点附近的网格坐标。目标 CAS 的 x、 y 和 z 轴坐标数值分别取 90.81、 83.98 和-8.04。在对范德华力和静电项的计算中,分别使用自动对接参数集和距离依赖性介电函数。使用「Lamarckian 遗传算法」和「Solis & Wets 局部搜索方法」进行对接模拟。随机设定配体分子的扭矩。每项对接实验都是来自 100 次不同的运行,设定运行在最多 2,500,000 次能量评估后终止。将群体大小设定为 150。在 Discovery Studio Visualizer(Accelrys) 的帮助下生成最终数据。
 

4 研究结果与讨论 


一些证据提示,两种最常见的老年退行性疾病——T2DM 和 AD 之间存在很强的关联。 T2DM 患者和 AD 患者脑部均可见胰岛素抵抗和胰岛素信号传导功能紊乱。近期证据指出,噻唑烷二酮类药物 [过氧化物酶体增殖物激活受体γ( peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ) 激动剂] 治疗糖尿病可减少颅内的淀粉样蛋白β肽沉积,后者是 AD 老年斑块的核心成分。

尽管二者之间的确切关联尚未明确,但这些报告提示开发治疗 T2DM 的药物可能同时有助于改善 AD 的病理生理学和维护认知功能。因此,本研究尝试使用降糖药格列美脲来明确 AD 与 T2DM 之间的双重治疗关联。格列美脲具有刺激 PPARγ活性的作用。既往曾发现格列美脲可通过抑制 ACEI 活性中断淀粉样蛋白β的产生,使其成为一种极具前景的治疗 T2DM 相关性 AD 的药物。相似的,另一种噻唑烷二酮衍生物吡格列酮也被视为潜在 AD 治疗药物。曾有研究报告长期使用吡格列酮可改善 AD 模型小鼠的记忆力。

本研究中使用 ATCI 作为一种底物,显示格列美脲具有显著的剂量依赖性 AChE 抑制作用。关于对 AChE 的抑制作用, 250 μg/mL 浓度的格列美脲显示接近 51.37% 的抑制活性,抑制浓度 (inhibitory concentration, IC50) 数值为 235μM。同样,研究发现,从尼日利亚文殊兰中提取的一种扁担叶碱的 IC50 数值为 250μM,一种四氢喹啉衍生物的 IC50 数值为 215μM。尽管格列美脲的活性为中等,但可作为合成提高双重抑制活性的潜在类似物的引子。

在对罗格列酮和吡格列酮的分析中也获得了鼓舞人心的结果。对轻度 AD 患者的一项临床研究显示,接受罗格列酮治疗 6 个月可使患者的记忆力和注意力得到改善。一项随机试验发现, AD 合并 T2DM 患者接受吡格列酮治疗 6 个月后,空腹血浆胰岛素水平降低,认知功能和脑灌注情况得到改善。

这些报告提示,识别噻唑烷二酮类模板的关键结构特征将有助于设计和合成既可改善 AChE 抑制活性又可减少 Aβ肽沉积和聚集的新的类似物。而我们之前关于其他降糖药 (坎格列净和达格列净) 的研究也显示了这类药物抑制 AChE 活性的有利结论。为了阐明格列美脲抑制 AChE 的机制,进行了酶活性的动力学研究。图 1 为格列美脲对 ATCI 水解抑制的双倒数图。底物浓度和反应速度之间的关系与 Michaelis–Menten 方程非常相符。动力学研究显示,格列美脲的 Km 数值增高,而最大酶活性速度或 Vmax 无明显变化。

该结果证实了对 AChE 的竞争性抑制机制。同样,也有研究观察到一些抗 AChE 化合物的竞争性抑制作用。

为了进一步了解格列美脲与 AChE 活性位点残基的相互作用并研究基本作用机制,进行了分子对接研究。发现 AChE 的催化活性位点 (CAS) 与格列美脲通过 20 个氨基酸残基相互作用,即 Q71、 Y72、V73、 D74、 W86、 N87、 P88、 G121、 G122、Y124、 S125、 G126、 W286、 F295、 F295、 F297、Y337、 F338、 Y341 和 H447(见图 2,表 1)。近期一些研究发现相同的 AChE 氨基酸残基在配体结合中发挥重要作用,我们的结果与这些研究发现相一致。因此,推测理想的 AChE 抑制剂应同时与催化和周围位点结合,以此破坏酶与 Aβ肽的相互作用,并因此延缓疾病的进展。对形成键的性质和数量的进一步研究发现氢键、极性键和疏水作用在「格列美脲- AChE」相互作用中扮演重要角色。相应的,发现格列美脲的一个氮原子 (即 N1) 和一个氧原子 (即 O4) 参与 AChE 活性位点 W86 和 S203 氨基酸残基之间的氢键形成。这与我们之前发现 AChE 抑制剂研究中 AChE 氨基酸残基 W86 和 S203 氢键形成的报告相一致。这里,发现有 5 个 AChE 氨基酸残基 (即 Y124、 L130、 F297、 F338 和 I451) 通过疏水作用与格列美脲产生相互作用。可以想象,这些补充的相互作用进一步增强了结合的亲和力,进而使抑制作用大幅提高。格列美脲与 AChE 相互作用的「范德华力」、「氢键」和溶解能量部分构成的能量数值共计-7.37kcal/mol。除此之外,上述相互作用的「静电能量」为-0.07kcal/mol。在相同的适宜对接条件下, AChI 对接至相同的。

AChE 结合区域。观察到在与 AChI 的结合中,氨基酸残基 Q71、 Y72、 V73、 D74、 T83、 W86、 N87、Y124、 S125、 W286、 S293、 V294、 F295、 R296、F297、 Y337、 F338 和 Y341 发挥主要作用 (见图 3,表 1)。有趣的是,发现 AChE 的氨基酸残基 Q71、Y72、 V73、 D74、 W86、 N87、 Y124、 S125、W286、 F295、 F297、 Y337、 F338 和 Y341 也参与 
格列美脲的相互作用 (见表 1)。为了更好地理解格列美脲和底物 A C h I 是如何影响与 A C h I 的结合方式的,评估了两种化合物结合的游离能量。

结果显示,我们「AChI-AChE」结合的游离能量数值 (ΔG) 为-4.75kcal/mol,「格列美脲-AChE」则为 5.21kcal/mol。由此验证了格列美脲与 AChE 活性位点的竞争性结合特性。

结合能量确定了配体与酶之间相互作用的强度。在酶的受体位点或酶的活性位点形成最佳结合异构体的结果是产生最低的结合能量。对接的配体 (格列美脲) 与 AChE 的结合能量数值是可接受的。这些结果提示上述药物可作为对 T2DM 和 AD 有双重抑制作用的药物。由于 T2DM 的发生与 AD 相关,基于降糖药骨架设计新的 AChE 抑制剂具有重要意义。此外,由于乙酰胆碱酯酶抑制活性的 IC50 数值似乎低于有显著统计学意义的水平,尚需要进行更多关于马血清和人乙酰胆碱酯酶的酶抑制研究,以完善对检验分子的胆碱酯酶抑制特征的描述。
 

5 结论 


本研究中,将实验动力学检测与计算机模拟研究相结合,对降糖药格列美脲拮抗 AChE 酶的活性进行了观察。动力学研究验证了格列美脲的对 AChE 的竞争性抑制作用,这一点也在应用计算机模拟研究中得到支持。发现格列美脲与 AChE 酶结合的位点和 AChI 显示竞争性结合性质的位点相同,且在 AChE 酶与两种研究配体的相互作用中,有 14 个共同的氨基酸残基 (即 Q71、 Y72、 V73、 D74、W86、 N87、 Y124、 S125、 W286、 F295、 F297、Y337、 F338 和 Y341)。

这些发现可部分解释格列美脲对 AD 的有利效应,并为设计和开发降糖药来源的 AChE 抑制剂提供了理论基础。总之,我们的结果显示,格列美脲可作为一种有效的抗 AD 和 T2DM 的双重治疗药物。将抑制动力学研究与计算机模型研究相结合,为开发更有效的具有双重功效的 AChE 抑制剂提供了重要的线索。

文章内容转载自药品评价杂志2017年第13期

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学到了
发表于 2018-08-27
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值得学习。
发表于 2018-08-27
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新观点,耳目一新
发表于 2017-11-23
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