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艾地苯醌神经保护作用对于毛果芸香碱诱导的癫痫
时间:2017-08-10 10:57:44

——改变抗氧化状态,DNA 损伤程度和钠钾 ATP 酶活性,大鼠海马做实验

摘要:本篇研究探讨艾地苯醌对于毛果芸香碱诱导的癫痫和海马损伤的神经保护作用。艾地苯醌具有抗氧化和促进 ATP 合成的作用。耐受性好 毒性低。之前有报道艾地苯醌对 FA 和 AD 神经保护作用的研究,但没有癫痫模型的相关研究。

大鼠随机分为 6 组(n = 25),其中两组腹腔注射生理盐水(0.9% i.p.  空白组)或者艾地苯醌(200 mg/kg,i.p.  Ideb 200 组)连续 3 天。其他四组(P400, Ideb50 + P400, Ideb100 +P400, and Ideb200+P400)对应接受生理盐水或者艾地苯醌(50,100,200 mg/kg, i.p.)连续 3 天,然后注射毛果芸香碱(400 mg/kg,i.p.)。注射完毛果芸香碱后观察 6 h。记录首次癫痫发作潜伏期,癫痫发作百分比和生存率。幸存的大鼠,分离出海马组织,测量脂质过氧化,硝酸盐/亚硝酸盐比值,谷胱甘肽和 DNA 断裂情况,以及过氧化氢酶和钠钾 ATP 酶活性。

结果表明呈剂量依赖性,艾地苯醌(100,200 mg/kg)延长首次癫痫发作的潜伏期,提高生存率,降低癫痫发作百分比。毛果芸香碱组脂质过氧化水平、硝酸盐/亚硝酸盐比值、DNA 断裂情况、过氧化氢酶活性显著增加,谷胱甘肽含量和钠钾 ATP 酶活性显著降低。艾地苯醌(100,200 mg/kg,i.p.)预处理(注射毛果芸香碱的大鼠),显著降低脂质过氧化水平,过氧化氢酶活性趋于正常,且艾地苯醌纠正大脑海马谷胱甘肽含量和钠钾 ATP 酶活性。毛果芸香碱诱导的癫痫中氧化应激是核心因素,艾地苯醌在癫痫模型中发挥了神经保护和抗氧化的作用。

简介:毛果芸香碱诱导的癫痫是颞叶癫痫常用病理模型,临床最常见的癫痫发作模式。大剂量毛果芸香碱(拟胆碱药惊厥剂)诱发大鼠出现自发性复发性癫痫 (spontaneous recurrent seizures,SRS),和人颞叶癫痫有类似的神经损伤、行为特点和脑电图模式。并且,毛果芸香碱诱导的癫痫容易耐抗癫痫药物治疗,和颞叶癫痫类似情况。大脑区域中,海马尤其易受影响。癫痫模型表现出焦虑行为和显著的记忆学习能力受损。癫痫模型和大脑氧化损伤之前关系密切,之前有研究表明抗氧化剂治疗对于癫痫模型神经毒性和氧化应激的保护效果,比如硫辛酸,维生素 E 和维生素 C。

艾地苯醌是一种苯醌衍生物,辅酶 Q10 的短链合成类似物。是一种抗氧化剂,同时促进电子流,增加 ATP 的合成。艾地苯醌可被迅速的吸收,在脑内维持较高的浓度。毒性极低,对于亚急性和慢性疾病耐受性好。基础研究表明验证艾地苯醌对脑血管疾病的疗效。基于艾地苯醌的抗氧化特性,此研究探讨艾地苯醌对毛果芸香碱诱导大鼠癫痫的保护作用,以及其中的机制,试验设置了艾地苯醌不同浓度对癫痫模型发作率和死亡率的影响。

结果:

1.  艾地苯醌预处理对于毛果芸香碱诱导大鼠行为的变化

毛果芸香碱(400 mg/kg)诱导大鼠外周胆碱能症状(腹泻、瞳孔缩小、立毛、咀嚼动作),32 分钟内癫痫发作,80% 的测验动物中(p<0.001)。6 小时存活百分比 60% 相比于空白对照组。

艾地苯醌预处理延长类胆碱反应的发生,癫痫首次发作的潜伏期延长,随着艾地苯醌浓度增加,癫痫发作的百分比逐渐降低,生存率升高。

2.  分离海马组织,测海马中脂质过氧化水平(通过丙二醛 MDA 含量)、NO 含量(硝酸盐/亚硝酸盐)、谷胱甘肽含量(一种重要抗氧化剂)、过氧化氢酶含量。结果艾地苯醌降低过氧化水平、降低 NO 含量,增加谷胱甘肽含量,降低过氧化氢酶活性。

3.  艾地苯醌对海马组织 DNA 断裂的影响

P400 增加海马 DNA 断裂 1.9 倍,Ideb200 显著降低 DNA 断裂。

4.  艾地苯醌对海马组织钠钾 ATP 酶活性

钠钾 ATP 酶活性,神经细胞膜完整的标志物,P400 显著降低其活性,Ideb200 逆转 ATP 酶活性的变化。

讨论:毛果芸香碱诱导的癫痫模型出现氧化应激/氮化应激、脂质过氧化、离子失衡、ATP 合成减少、NO 含量增加,引发癫痫发作、神经损伤和死亡。

注:NO 可能通过 GABA 能和谷氨酸能神经递质引发癫痫;另外,之前有研究脂质过氧化激活 iNOS 促进巨噬细胞释放 NO,NO 和超氧化物相互作用,生成强氧化剂和亚硝基化剂。NO 是一种潜在的线粒体呼吸抑制剂,因为和氧气竞争结合细胞色素氧化酶,抑制能量的生成。

正常情况下,大脑内自由基会被自身防御系统清除,如过氧化氢酶和其他抗氧化酶。过氧化氢酶会把过氧化氢转化为水。过氧化氢很容易透过细胞脂质膜,参与羟基自由基的形成。此外,过氧化氢可以和硫醇化合物反应。过氧化氢酶活性的增加可以归因于癫痫代谢的增加,据报道,毛果芸香碱癫痫模型可直接导致大脑过氧化氢酶代偿性表达,和活性的增加,是细胞对 ROS 形成增加的一种反应,预防神经损伤。

艾地苯醌可以提供有效的神经保护抵抗毛果芸香碱引起的脂质过氧化和氮化应激,可能通过提高 GSH 含量,恢复正常过氧化氢酶活性。艾地苯醌限制自由基过量生成,从而维持抗氧化酶的正常活性。

癫痫模型表现 caspase-3 活性增加和 DNA 断裂,DNA 断裂是组织氧化损伤和凋亡的标志,艾地苯醌防治氧化应激,抑制 DNA 断裂,抑制凋亡。也有相似研究表明艾地苯醌可以抑制培养的人星形胶质细胞凋亡。

钠钾 ATP 酶对于维持神经细胞膜离子浓度梯度非常重要。此外也是细胞膜完整性的标志由于其巯基集团,对氧化应激十分敏感。钠钾 ATP 活性的抑制可以增加细胞兴奋度,诱导癫痫发生。ATP 合成显著降低,也会降低 ATP 依赖酶活性,包括电子转运酶钠钾 ATP 酶。艾地苯醌的抗氧化活性防止钠钾 ATP 酶巯基集团被氧化,保护脂质膜。

总结:此研究揭示艾地苯醌(100 和 200 mg/kg)对于毛果芸香碱诱导大鼠癫痫具有抗痉挛和神经保护作用。通过分离海马组织 评测相应物质含量活性揭示艾地苯醌在抗氧化、抗氮化应激,调整谷胱甘肽 GSH、过氧化氢酶活性、钠钾 ATP 酶活性、DNA 断裂方面的积极作用。

原料药:Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)